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增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative Vitreoretinopathy,PVR)是一种致盲性眼底疾病,常见于孔源性视网膜脱离(Rhegmatogenous retinal detachment,RRD)、眼外伤和内眼手术后。PVR被认为是视网膜过度损伤修复的过程,其特点是在玻璃体腔和视网膜周围形成了可收缩的纤维增殖膜,目前,手术仍是PVR的主要治疗方法,尽管手术技术在不断提高,但PVR的手术效果仍不尽如人意,是视网膜脱离及眼外伤手术失败的主要原因。因此,从PVR的发病机理入手,探索预防及治疗PVR的新方法以提高术后视功能就显得尤为重要。PVR的发病机制错综复杂,生长因子,细胞因子,细胞外基质和多种细胞之间的相互作用均参与其中。目前研究多表明视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium,RPE)细胞是PVR发生发展的关键细胞之一。在正常生理状态下,分化成熟的RPE细胞一直处于静止不分裂状态,对维持视网膜和脉络膜的正常功能具有重要作用。然而当视网膜出现裂孔或眼球受到外伤引起视网膜脱离时,多种因素导致RPE细胞的连接复合体被破坏,与Bruch膜分离,迁移至视网膜神经上皮缺损处,发生增生并转化为肌成纤维细胞,形成纤维增殖膜,最终加剧视网膜脱离导致视力进一步下降。在这一过程中RPE细胞发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),由上皮细胞转化为间质细胞,使其增殖、迁移、抗凋亡能力增强,并且分泌细胞外基质增多,在PVR形成过程中发挥着关键的作用。CD44为广泛表达于多种细胞的跨膜糖蛋白,参与生长发育、炎症、免疫反应、损伤修复、肿瘤转移等多种病理生理过程的调节。CD44不仅可通过与细胞外配体结合形成跨膜复合体,而且可通过与细胞内骨架蛋白结合来调节多条细胞信号通路的传导,从而对多种细胞功能进行调节,如细胞生长,细胞分化和细胞迁移。正常的RPE细胞处于静止不分裂状态,不表达CD44,而在病理状态如RRD中,RPE细胞发生增殖和迁移,出现CD44的表达,且RPE细胞CD44的表达变化与RRD的病理发展关系密切。有研究表明CD44可促进肺脏、肝脏、肾脏等其它脏器发生纤维化,但CD44在PVR发生发展过程中的作用还有待进一步研究。4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone,4MU)是一种香豆素衍生物,具有利胆和抗痉挛的作用。4MU不仅可以通过抑制透明质酸的合成来发挥抗肿瘤、抗炎及抗纤维化的作用,而且还可以使CD44的表达下调,抑制细胞内信号通路的传导,从而使细胞的增殖和迁移能力降低。因此,我们推测4MU可能也对RPE细胞的增殖和迁移具有抑制作用,从而阻止PVR中细胞纤维膜的形成。因此本研究先收集PVR患者的增殖膜,检测增殖膜中CD44的表达情况,然后利用TGF-β2建立ARPE-19细胞发生EMT的体外模型,并对CD44和4MU在RPE细胞EMT中的作用及分子机制进行研究,进一步阐明PVR的发生和发展机制,为临床上对该疾病的预防和治疗提供理论依据。目的:检测CD44在PVR增殖膜中的表达情况;研究CD44在ARPE-19细胞发生上皮间质转化中的作用及机制;并进一步探索4MU对ARPE-19细胞EMT的作用及机制。方法:1.临床手术中收集PVR患者的增殖膜样本,并利用免疫荧光技术检测CD44和细胞角蛋白CK-18的表达情况。2.利用TGF-β2建立ARPE-19细胞EMT体外模型,观察RPE细胞的形态变化情况,用CCK-8法检测TGF-β2处理24小时后ARPE-19细胞的增殖,通过细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测RPE细胞迁移能力,用Western Blot检测ARPE-19细胞间质型蛋白α-SMA、Fibronectin(FN)、N-cadherin和Vimentin的表达水平。另外,在TGF-β2处理的不同时间点,检测CD44蛋白及间质型蛋白的表达情况。3.向ARPE-19细胞转染CD44si RNA,在转染并经TGF-β2作用后检测各组RPE细胞的增殖活力及迁移能力;转染后并经TGF-β2作用48h时用Western Blot检测α-SMA、FN、N-cadherin、Vimentin、Smad2/Smad3和磷酸化Smad2/磷酸化Smad3的表达水平。4.利用CD44抗体抑制CD44的作用,先向ARPE-19细胞给予浓度为20μg/m L的Ig G抗体/CD44抗体作用后再给予TGF-β2处理,用Western Blot检测α-SMA、FN、N-cadherin、Vimentin、Smad2/Smad3和磷酸化Smad2/磷酸化Smad3的表达水平。5.向ARPE-19细胞加入不同浓度的4MU进行培养,检测RPE细胞的增殖及迁移情况,并通过Western Blot检测RPE细胞CD44及间质型蛋白α-SMA、FN、N-cadherin、Vimentin的表达情况,筛选合适的4MU浓度。6.我们选择0.8m M为4MU的作用浓度,将实验分为三组,分别为对照组,TGF-β2组和TGF-β2+4MU组,对照组为正常培养的ARPE-19细胞,TGF-β2组是给予浓度为10ng/m L的TGF-β2作用的ARPE-19细胞,TGF-β2+4MU组是同时给予浓度为10ng/m L的TGF-β2和浓度为0.8m M的4MU作用的ARPE-19细胞。应用CCK-8试剂盒检测各组RPE细胞的增殖能力,利用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验来检测4MU对TGF-β2诱导的RPE细胞迁移的影响,用Western Blot检测各组RPE细胞CD44、α-SMA、FN、N-cadherin、Vimentin、Smad2/Smad3和磷酸化Smad2/磷酸化Smad3的表达情况。结果:1.收集了6例PVR患者的增殖膜样本,PVR增殖膜的免疫荧光检测结果显示:6例PVR患者的增殖膜上均能检测到CD44表达,且CD44和细胞角蛋白CK-18存在共定位。2.TGF-β2作用后的ARPE-19细胞由鹅卵石样上皮细胞形态转变为长梭形的纤维细胞样形态。CCK-8的结果显示与对照组相比,TGF-β2对RPE细胞的增殖有促进作用(P<0.0001)。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示TGF-β2促进RPE细胞的迁移(P<0.05)。TGF-β2组RPE细胞的α-SMA、FN、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平较对照组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。TGF-β2使CD44蛋白表达上调,且在TGF-β2诱导24h时CD44表达最多,48h时CD44有下调的趋势,但与24h之间的差异无统计学意义(P=0.3919)。间质型蛋白α-SMA、FN、N-cadherin和Vimentin的表达水平随着TGF-β2作用时间延长而增加,都在TGF-β2诱导48h时表达最多。3.用CD44si RNA敲低了ARPE-19细胞CD44的表达,各组之间进行比较分析,结果显示与TGF-β2组和NCsi RNA+TGF-β2组相比,CD44si RNA+TGF-β2组RPE细胞的增殖能力降低(P<0.05);24h和48h时CD44si RNA+TGF-β2组细胞划痕愈合的面积较前两者的减小(P<0.05);24h时CD44si RNA+TGF-β2组迁移至下室的RPE细胞也明显减少(P<0.05);48h时CD44si RNA+TGF-β2组间质型蛋白α-SMA、FN、N-cadherin和Vimentin的表达水平下降(P<0.05),且磷酸化Smad2/磷酸化Smad3蛋白与总的Smad2/Smad3蛋白的比值也降低。4.将CD44m Ab+TGF-β2组分别与TGF-β2组、Ig Gm Ab+TGF-β2组进行组间比较,结果显示CD44m Ab+TGF-β2组α-SMA、FN、N-cadherin和Vimentin的表达水平及磷酸化Smad2/磷酸化Smad3蛋白与总的Smad2/Smad3蛋白的比值较后两组的都降低,差异有统计学意义(P<0.05)。5.在4MU作用24小时,与对照组相比,浓度为0.2m M的4MU对ARPE-19细胞的增殖无明显抑制作用(P=0.1237),另外4种浓度的4MU对RPE细胞的增殖均有抑制作用(P<0.05),而在作用48h时,不同浓度4MU组ARPE-19细胞的增殖能力都较对照组降低(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,与对照组进行比较,4MU抑制ARPE-19细胞的迁移,且呈现时间和浓度依赖性(P<0.05)。4MU使ARPE-19细胞CD44和间质型蛋白α-SMA、FN、N-cadherin和Vimentin的表达降低,且浓度为0.8m M的4MU的抑制作用最明显。6.CCK-8的结果显示TGF-β2+4MU组RPE细胞的增殖活性较TGF-β2组的降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示在24h和48h时,TGF-β2+4MU组的RPE细胞划痕愈合面积较TGF-β2组的减小(P<0.05)。Transwell细胞迁移实验结果显示与TGF-β2组相比,TGF-β2+4MU组RPE细胞的迁移能力降低(P<0.05)。蛋白印迹结果显示TGF-β2+4MU组ARPE-19细胞的间质型蛋白α-SMA、FN、N-cadherin和Vimentin的表达水平及磷酸化Smad2/磷酸化Smad3蛋白与总的Smad2/Smad3蛋白的比值低于TGF-β2组的(P<0.05)。结论:1.PVR增殖膜中的RPE细胞有CD44的表达。2.TGF-β2促进体外ARPE-19细胞发生EMT,且ARPE-19细胞在发生EMT过程中伴随了CD44的上调。3.CD44si RNA和CD44抗体可能通过抑制Smad2和Smad3的磷酸化来抑制RPE细胞发生EMT。4.4MU可能通过SMAD通路抑制TGF-β2诱导的RPE细胞EMT。