现今越来越受关注的可再生生物质原料,可以替代全球范围有限的能源资源,生产生物燃料和化学品等。这些材料往往具有资源充足、成本低、对环境友好以及无温室气体排放等优势。与传统生物转化方法相比,新开发的整合生物加工(ConsolidatedBioproccssing,CBP)技术将酶的生产、生物质的水解、糖的发酵整合到一个单一微生物,避免了复杂生物转化过程的高成本。本论文目标是利用半纤维素降解菌株筛选、酿酒酵母表面展示技术和酿酒酵母组成型启动子评估等策略,发掘一条潜在的通过生物质转化技术实现生物燃料和化学品生产的路线,为整合生物加工的工业化利用打下基础。　　全文以木聚糖(半纤维素主要成分)作为整合生物加工的原料,首先我们从自然界中筛选高产木聚糖酶的菌株,利用基于96孔深孔板的筛选方法对其中202株菌株进行了快速复筛,共得到13株高产木聚糖酶的菌株,其中以编号ECU2023的酶活力最高,鉴定为泡盛曲霉。对其培养条件进行了初步优化,确定pH值为6.0,培养时间为4天,碳源为3-4％玉米芯粉。　　然后我们尝试改造酿酒酵母组装多个木聚糖酶,生产生物燃料乙醇。酿酒酵母是一个被广泛应用的基因工程菌株,具有多种优越的性能,包括乙醇耐受度高、工业发酵水平稳定、可利用基因工程技术成熟、实验室常用安全微生物等等。已报道过利用重组酿酒酵母生产一系列重要的高附加值化合物,比如类固醇氢化可的松、生物碱、萜类化合物青蒿酸、紫杉二烯、非核糖体抗生素前体等。此外,最为重要的是利用酿酒酵母可以生产高级生物燃料,以便解决与全球能源息息相关的世界性难题。重组改造的酿酒酵母可以作为整细胞生物催化剂,将半纤维素酶的生产、木聚糖的酶促水解与五碳糖的发酵整合到一步。这一系列的重组酿酒酵母表面分别展示了单酶、双酶、三酶半纤维小体,由骨架蛋白(CipA3/CipA1)和嵌合半纤维素酶组成。骨架蛋白包含了一个或三个黏附结构域,通过酿酒酵母a凝集素受体连接到细胞表面。三个嵌合半纤维素酶分别为内切木聚糖酶(XynⅡ)、阿拉伯糖呋喃糖苷酶(AbfB)和木糖苷酶(XInD),每个嵌合酶都融合了锚定结构域。在酿酒酵母分泌信号肽的指引下,所有半纤维小体组分都分泌到胞外,通过高亲和力黏附一锚定作用组装到一起。与单酶、双酶半纤维小体相比,三酶半纤维小体复合物表现出了较快的阿拉伯糖基木聚糖降解速率。进一步将木糖代谢途径整合到基因组,发现带有双酶半纤维小体的重组酿酒酵母可以同步糖化与发酵桦木木聚糖为乙醇,得率为每消耗一克木聚糖生成0.31 g乙醇。　　最后为了优化木聚糖代谢途径,我们表征了一系列酿酒酵母组成型启动子。实验室规模条件下,大多数酿酒酵母代谢途径的组成型启动子未被表征和比较,可用于复杂生化途径构建的启动子数量十分有限。因此我们克隆了14个来自酿酒酵母的组成型启动子,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,改变环境中葡萄糖浓度和氧浓度来评估启动子强度大小。结果表明,绿色荧光蛋白的表达量差异不超过6倍,启动子TEF1p的强度最高,而启动子PGI1p的强度最弱。高强度和中等强度的启动子分别被用于调控木聚糖降解途径和玉米黄质生物合成途径,同时在重组酿酒酵母体内引入异源木糖代谢途径,实现了直接从桦木木聚糖生成玉米黄质的整合生物加工,玉米黄质的产量为0.74±0.02 mg/L。　　然而这些研究只是构建整合生物加工重组菌株的初步策略,仍然存在多个难题,比如表面展示效率低、代谢途径负担重、诱导步骤繁琐、质粒不稳定等等。重组酿酒酵母利用天然底物的能力是实现整合生物加工的关键性因素之一,如何连续性地和组成型地表达外源蛋白是下一步研究的重点。值得一提的是,本论文同步糖化与发酵桦木木聚糖生成玉米黄质和乙醇的工作,证实了整合生物加工的可行性。