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人乙型肝炎(Heptitis B)是危害人类健康的主要疾病之一,全世界乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者超过4亿人。预防和治疗乙型肝炎的主要手段是使用疫苗免疫或化学药物。我国用于治疗人类乙型肝炎的药物大多依靠进口或仿制,在临床应用上尚无疗效显著的具有自主知识产权的原创药物。本文在调查河南省樱桃谷鸭主产区鸭乙肝病毒(Duck heptitis B virus, DHBV)自然率的基础上,分析其分子流行病学特征并建立鸭乙肝动物模型。同时,应用建立的检测DHBV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并结合病理学检查评价具有自主知识产权新药FNC抗鸭乙型肝炎的疗效,结果如下:为了解河南省樱桃谷鸭中鸭乙肝病毒的自然感染率以及基因结构特征,从河南省樱桃谷鸭主产区信阳、郑州、焦作三地采集樱桃谷鸭血清并用PCR检测,将三地检测到的DHBV阳性鸭血清各挑取一份进行全基因组的扩增,并进行克隆与序列测定分析。结果表明,信阳、郑州、焦作三地樱桃谷鸭DHBV自然携带率分别为10.5%、8.9%、42.9%,病毒基因组全长分别为3021bp、3027bp、3024 bp,均编码P , S和C蛋白的三个开放阅读框,核苷酸同源性为89.8%～93.9%,各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显著地方位于P区。与GenBank已公布的DHBV全基因比对,相似性为89.4%～99.5%。全基因组进化树分析表明得到的信阳分离株为西方基因型,其余两株均为中国基因型的一个亚型。进一步研究表明S-ORF在1～35aa内有一个明显的信号肤,在27～29aa处有裂解位点,抗原位点主要分布于PreS区氨基酸序列中。为建立一种快速、特异的DHBV-DNA SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。参考Günther等扩增HBV基因组的引物设计策略,设计扩增DHBV基因组的引物,并将DHBV基因组扩增产物克隆到pMD-18-T载体上。然后以该重组质粒为模板,选择DHBV S基因保守序列设计一对定量PCR引物,构建了标准曲线,进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,该方法能特异性定量检测DHBV-DNA;检测范围在7.02×108～7.02×104拷贝/μL之间有良好的线性关系,相关系数为1.00,扩增效率为105%;敏感度高,最低检测限为70个拷贝。建立的DHBV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等优点,可用于DHBV-DNA的定量检测和抗DHBV药物的评价。为了研究FNC的体内抗DHBV效果,选用3日龄樱桃谷鸭感染DHBV,7天后用PCR法筛选出DHBV阳性鸭,随机分为FNC高、中、低剂量组、拉米夫定对照组和生理盐水对照组,每组16只,各组均灌服给药10天,于用药前(T0)、用药第5天(T5)、用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)分别采取血液和肝组织,用荧光定量PCR方法检测血清和肝脏中DHBV-DNA含量,用全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)水平,取肝组织作常规HE染色观察病理变化。结果显示:给药5天、10天时血清和肝组织中DHBV-DNA总体水平显著下降(P<0.05),停药后第3天DHBV-DNA含量较用药时有所回升。FNC高剂量组和拉米夫定对照组对DHBV-DNA的抑制率差异不显著(P>0.05)。用药前期ALT、AST药物组与生理盐水对照组相比差异显著,后期差异不显著。肝组织病理切片显示FNC高剂量组与拉米夫定组炎症改善情况相当。结果表明,FNC在体内有显著的抗DHBV作用。本试验为进一步深入研究和开发FNC治疗乙型肝炎新药提供了理论及实验依据。