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背景与目的:早在半个多世纪之前,临床观察和动物实验的结果表明,减少血小板可以显著抑制肿瘤生长和转移。但是血小板减少引起出血而限制其临床应用。活化的血小板和血管内皮细胞表达P-选择素,参与血小板粘附于肿瘤细胞和肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附。P-选择素对肿瘤的作用如何?P-选择素是否可以通过介导血小板-肿瘤细胞的相互作用影响肿瘤的生长,目前尚不清楚。血清淀粉样P蛋白(SAP)和C-反应蛋白(CRP)是一类具有钙依赖结合活性的血浆蛋白,在急性炎症反应中会急剧上调表达,其中SAP主要在小鼠炎症中上调,而人体炎症中主要是CRP上调。耿建国教授课题组从人血小板中共沉淀一种分子量约为28kDa的糖蛋白,并证实该蛋白为SAP,通过体内外研究发现SAP可以特异性和P-选择素结合,并抑制P-选择素介导细胞粘附和炎症反应。那么SAP能否抑制P-选择素介导的血小板粘附对肿瘤作用呢?本研究拟全面探讨P-选择素对肿瘤生长和转移的作用,P-选择素介导的血小板粘附于肿瘤细胞对肿瘤生长的作用,以及SAP能否抑制P-选择素介导的血小板粘附对肿瘤的作用。方法:1、P-选择素对肿瘤生长的作用采用P-选择素敲除小鼠和C57小鼠,皮下接种B16黑色素瘤细胞,建立皮下移植瘤模型,通过测量肿瘤体积及记录小鼠的生存期,探讨P-选择素对肿瘤生长的作用。通过Rip1-Tag2小鼠与P-选择素敲除小鼠杂交,建立PKO/Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞瘤自发生长模型,并设PKO/Rip1-Tag2小鼠为实验组,而Rip1-Tag2小鼠为对照组。通过计数血性胰岛、胰岛β细胞瘤数目,以及测量肿瘤的体积,探讨P-选择素对肿瘤生长的作用。用免疫组化技术检测肿瘤组织中与肿瘤增殖、凋亡、血管相关的标记性分子如Brdu、MDV、Tunel等,分析P-selectin对肿瘤增殖、凋亡及血管形成的影响。2、P-选择素对肿瘤转移的作用分别给P-选择素敲除小鼠和C57小鼠尾静脉注射B16黑色素瘤细胞,建立转移瘤模型,通过记录转移到肺及肝表面的肿瘤结节数目,观察P-选择素对肿瘤转移的作用。3、血小板对Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞肿瘤生长的作用通过给Rip1-Tag2小鼠注射抗血小板抗体GPIbalpha抗体(实验组)及其对照抗体(对照组),造成实验鼠的低血小板血症,通过计数Rip1-Tag2小鼠的血性胰岛和胰岛β细胞瘤数目,并测量肿瘤体积,来观察血小板对Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞肿瘤生长的作用。4、血小板在小鼠肿瘤中的分布特征分离PKO/ Rip1-Tag2和Rip1-Tag2小鼠胰腺,冰冻切片后,用免疫荧光(IF)方法检测血小板标记性分子CD41的表达,分析血小板在小鼠肿瘤中的分布。5、P-选择素介导血小板粘附对肿瘤生长的作用为了研究P-选择素介导血小板粘附对肿瘤生长的作用,分离P-选择素敲除小鼠(实验组)或C57小鼠(对照组)的血小板后,回输给PKO/Rip1-Tag2小鼠,然后计数小鼠的肿瘤和血性胰岛的数目及测量肿瘤体积,并检测CD41的表达。观察表达P-选凝素的血小板和P-选择素敲除的血小板对肿瘤生长的影响。6、用基因工程小鼠,研究SAP是否抑制P-选择素介导血小板粘附对肿瘤生长的作用用SAP-Tg小鼠与Rip1-Tag2小鼠杂交,建立SAP过表达的自发胰岛β细胞瘤小鼠模型(SAP-Tg/ Rip1-Tag2小鼠模型),并以SAP-Tg / Rip1-Tag2小鼠为实验组,而Rip1-Tag2小鼠为对照组。通过计数血性胰岛、胰岛β细胞瘤数目,以及测量肿瘤的体积,探讨SAP抑制P-选择素介导血小板粘附对肿瘤生长的作用。结果:1、建立的皮下移植瘤模型结果显示P-选择素敲除小鼠的肿瘤体积明显小于C57小鼠皮下移植瘤的体积,生存期也明显比C57小鼠长。而且PKO/ Rip1-Tag2小鼠血性胰岛的数目和肿瘤数目明显少于Rip1-Tag2小鼠,肿瘤体积也明显减小,PKO/ Rip1-Tag2的生存期也明显比Rip1-Tag2长。免疫组化结果显示PKO/ Rip1-Tag2小鼠肿瘤血管的密度及胰岛β细胞瘤细胞的Brdu增殖数目明显少于Rip1-Tag2小鼠,同时凋亡细胞数明显多于Rip1-Tag2小鼠。2、转移瘤模型结果表明P-选择素敲除小鼠转移到肺脏及肝脏的肿瘤结节数明显少于C57小鼠。3、为Rip1-Tag2小鼠注射抗血小板抗体GPIbalpha抗体及对照抗体后,发现Rip1-Tag2小鼠血小板水平降低后肿瘤体积明显减少,但是肿瘤数目及血性胰岛数目没有明显变化。4、用免疫荧光法检测PKO/Rip1-Tag2小鼠和Rip1-Tag2小鼠胰腺中血小板标记性分子CD41表达,发现PKO/Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞瘤组织中聚集的血小板明显少于Rip1-Tag2小鼠。5、通过给8周、10周时的PKO/Rip1-Tag2小鼠回输P-选择素敲除小鼠(实验组)和C57小鼠的(对照组)血小板发现,实验组小鼠的肿瘤数目和肿瘤体积明显少于对照组小鼠,但6周开始回输血小板的实验组和对照组小鼠的肿瘤数目及肿瘤体积没有显著差异。6、建立SAP-Tg/Rip1-Tag2小鼠模型发现,SAP-Tg/Rip1-Tag2小鼠的血性胰岛数目和肿瘤数目明显少于Rip1-Tag2小鼠,肿瘤体积也明显小于Rip1-Tag2小鼠。结论:1、P-选择素敲除抑制了肿瘤的生长。2、P-选择素敲除抑制了肿瘤的转移。3、血小板促进了Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞瘤的生长。4、P-选择素通过介导血小板粘附于胰岛β细胞瘤促进了肿瘤的生长。5、SAP抑制了P-选择素介导血小板的促肿瘤生长作用。