布比卡因是临床局部麻醉和疼痛治疗的常用药物,但可引起神经细胞凋亡,从而产生神经毒性,导致感觉和运动障碍,给患者的生产生活带来明显不良影响。医学统计结果表明实施椎管内麻醉的患者中有30%的患者发生了或轻或重的周围神经损伤,其中有0.01%的患者发生了严重的神经损伤并发症马尾综合/ 征。一项大样本多中心前瞻性研究调查结果显示,41,251例行蛛网膜下腔阻滞麻醉,35,379例行硬膜外麻醉和1,474例腰硬联合麻醉的手术患者,严重神经系统损伤并发症的发生率约为1.8/10,000。在Rorarius等研究中有219例患者在蛛网膜下腔阻滞麻醉下行剖宫产术,其使用的局麻药均为重比重的布比卡因,此类患者短暂性神经病学综合征的发生率约为8.8%。外周神经阻滞麻醉后发生神经损伤并发症的可能性比较大,Capdevila等研究结果显示1416例行外周神经阻滞麻醉的患者有3例发生了神经损伤并发症。为减少围术期并发症的发生和加速麻醉后的恢复,特别是高龄患者的日益增多,临床上神经阻滞麻醉的应用越来越多,局麻药引起周围神经毒性损伤的报道也随之增多。局麻药周围神经毒性损伤的确切机制尚未完全阐明,但目前较为一致的观点认为：高浓度,大剂量的局麻药作用于神经组织和细胞时,以及当局麻药与神经长时间和近距离的接触后,引起神经毒性反应的发生率明显增高目前,相关学者根据所了解的局麻药的周围神经毒性作用机制,研究药物防治其周围神经毒性损伤,并由此探寻新的防治途径,为进一步深入进行该领域的研究提供参考。姜黄素是一种低分子量多酚化合物,具有多方面的药理作用,在基因和细胞信号通路等多水平上具有抗氧化应激、抗炎以及调节凋亡等方面的作用,其作用机制可能有调节脑神经递质如γ-氨基丁酸、5-羟色胺、乙酰胆碱和多巴胺等的生成和释放、调控机体生理反应如下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的应激状态、增加亲神经营养因子的浓度等以增加神经细胞和组织再生的可能性,激活脑内多种信号传导通路引发级联反应,触发相关的多种反应,减少神经元凋亡,降低体内的细胞内活性氧簇(reactive oxygen species) ROS水平,抑制脂质过氧化反应,从而发挥神经保护作用。Zhuang等的研究结果表明在大鼠大脑皮层神经细胞氧化损伤的体外模型中,姜黄素可以减轻第三丁基过氧化氢诱导产生的神经细胞损伤作用,发现姜黄素预处理组的神经细胞凋亡阳性率明显减少,增强了Bcl-2/Bax和Fos表达水平,抑制了JUN和核内转录因子NF-KB表达水平,大脑皮层神经细胞存活率明显上升,细胞内活性氧族(ROS)的生成明显降低,还原型谷胱甘肽(GSH)含量增加。该研究结果说明姜黄素在体外可以通过抗氧化过脂质反应,减少自由基的生成和蓄积来减少氧化应激发生时神经细胞的凋亡和坏死。在孕鼠培养原代大脑皮质神经细胞的体外实验中,Lin MS等发现姜黄素对SD大鼠星形胶质细胞有神经保护作用,其可能的机制包括P13K和MAPK信号传导通路被激活,引起ANTES在星形胶质细胞中的表达水平明显升高,同时,星形胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase, iNOS)的活性降低,从而减少神经细胞的凋亡。研究表明,Aβ诱导神经细胞产生氧化应激反应,引起线粒体结构破坏和功能紊乱,凋亡相关蛋白(如细胞色素C、caspase-3、caspase-9和Bax等)的活化,进而导致细胞凋亡。姜黄素预处理可以活化神经细胞抗氧化酶系并提高其表达水平,降低Aβ诱导神经细胞产生氧化应激反应,稳定线粒体膜电位,触发一系列的神经保护反应,从而减弱Aβ导致的神经损伤。在中枢神经系统,姜黄素仍有广泛的作用靶点,其神经保护作用可能与促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平、Nrf2的核内转移和调节脑内多种信号级联反应等有关,但至今其确切机制仍未阐明。因此,其他蛋白基因、细胞因子或信号转导通路等是否参与了姜黄素的神经保护作用仍需要进一步的深入研究。SH-SY5Y细胞是人类神经母细胞瘤细胞亚系中结构和形态以及生化特性、比较稳定的一类神经终端分化细胞,适合在体外长时间培养,而且临床上神经系统疾病大都与神经元细胞调亡有关,所以SH-SY5Y细胞常用于构建神经细胞损伤模型,广泛应用于神经系统疾病的发病机制和预防的研究。在本实验中,SH-SY5Y细胞繁殖速度快,具有神经瘤样细胞特点,细胞形态小而圆,轴突较短,细胞质较少,有呈簇状生长的树突样突起,细胞生长状态良好,能为下一步细胞实验提供稳定的细胞来源。因此,本研究采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞构建布比卡因损伤模型。已有研究证实,细胞内和线粒体产生的ROS在局麻药所致的神经组织和细胞损伤中起到非常重要的病理生理作用,ROS的爆发性增高可能是导致神经组织细胞急性损伤的主要因素之一。局麻药引起人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞ROS水平急速升高的可能原因与ATP生成减少,单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)通路的激活有关。有研究表明姜黄素能作用于细胞内的抗氧化系统,增强抗氧化蛋白PRDX3 (Peroxiredoxin3)的表达。抗氧化蛋白PRDX3属于Peroxiredoxin抗氧化蛋白超家族,其催化活性和蛋白基因序列与其它抗氧化剂完全不同,因此它在清除活性氧族过程中所起到的作用也不同,所以成为近年来研究的热点。最新研究表明,该家族在细胞抗氧化、调控与过氧化氢相关的细胞通路、影响细胞分化和增殖、免疫反应及神经细胞凋亡等方面具有多重功能,在细胞抗氧化防御体系及维持线粒体内环境稳态过程中发挥重要作用。抗氧化蛋白PRDX3是近年来新发现的一类硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶,它在内质网中合成后经过线粒体定位信号转运至线粒体,而后存在于细胞线粒体基质内,是线粒体特有的过氧化物酶,其主要作用是通过硫氧还蛋白还原过氧化物或超氧化物达到清除线粒体内过氧化物的目的,从而减少ROS的产生。其生物学功能还包括调控细胞的活力；维持对氧自由基的敏感性；调节细胞内过氧化氢的浓度；促发细胞因子信号的级联放大反应等。在应激条件下,PRDX3表达水平增高,细胞内过多的氧自由基分子被清除。体外研究表明,小鼠巨噬细胞PRDX3表达水平在过氧化物的刺激下上升,巨噬细胞在抗氧化能力明显改善。Nonn等在实验中发现234567胸腺瘤细胞转染PRDX3蛋白后,组织对缺氧的耐受能力和抵抗药物诱导产生的细胞凋亡的能力显著提高,而培养细胞自身的凋亡率没有改变,该实验证明了PRDX3的强抗氧化作用。但姜黄素的抗氧化应激作用是否通过增加PRDX3蛋白的表达发挥神经保护作用,目前尚不清楚。苏氨酸-丝氨酸蛋白激酶B (Threonine-serine protein kinase B, Akt)信号通路是由磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)始动的生物信号转导通路,Akt是鼠类胸腺瘤病毒V-Akt致癌基因的同源物,因与蛋白激酶A和蛋白激酶C高度同源,故也称为蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)。Akt通过最小识别序列识别其下游底物,其磷酸化位点包括2个结构相似的AGC激酶、p90核糖体蛋白s6激酶(90 kDa ribosomal s6 kinase, p90RSK)和p70核糖体蛋白s6激酶(70 kDa ribosomal s6 kinase, p70S6K)。Akt处于该通路的中心环节,其功能涉及细胞增殖、细胞周期调控、凋亡启动、血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸方面,并在保护神经细胞功能障碍和凋亡过程中发挥重要的作用。其保护神经元存活的机制主要包括：(1)通过神经营养素如神经生长因子和神经营养因子等减少神经细胞生长锥萎陷等细胞结构的改变,从而抑制神经细胞凋亡;(2)通过磷酸化作用激活下游底物胱天蛋白酶(caspase)、p53、CREB和FHKRL1等减少细胞凋亡；(3)通过线粒体途径调控神经细胞凋亡；(4)通过红细胞生成素(erythropoietin, EPO)/红细胞生成素受体((erythro-poietin receptor, EPOR)系统抑制神经细胞的凋亡。Bhavana等体外研究结果显示激活Akt信号通路能减轻谷氨酸诱导的神经细胞凋亡。有在体实验表明激活Akt信号通路能减轻糖尿病大鼠视网膜细胞的凋亡。国内丁正年等人的相关研究证实,Akt信号通路与布比卡因诱导大鼠成神经细胞瘤2a细胞凋亡的保护机制有关。因此,我们推测Akt信号通路可能与布比卡因的神经损伤作用密切相关。本科研小组构建布比卡因损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型,通过细胞形态、细胞活力、细胞凋亡率和细胞内ROS水平以及线粒体膜电位等指标的变化明确姜黄素的神经保护作用；同时探讨Akt信号通路的激活是否与姜黄素的神经保护作用有关,而且运用小干扰RNA等分子生物学技术研究PRDX3蛋白在姜黄素减轻布比卡因所致的SH-SY5Y细胞的损伤中的作用。本研究明确其机制有利于今后减轻围手术期患者应用局麻药后神经毒性损伤,也为临床麻醉防治局麻药神经损伤提供了新的靶点和思路,为临床防治局麻药神经损伤提供新的理论依据。第1章布比卡因损伤SH-SY5Y细胞模型的构建目的构建布比卡因损伤SH-SY5Y细胞模型。方法体外培养SHSY5Y细胞,分为6组,C组为对照组(未经药物处理),Bup0.5～Bup2.5组(分别用0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mM布比卡因的培养液处理24h)。观察细胞形态,采用MTT法检测细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡,确定布比卡因的适宜浓度,建立布比卡因细胞损伤模型。统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。组内比较采用重复测量设计的方差分析,细胞活力和凋亡率组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。 P<0.05为差异有统计学意义。结果布比卡因处理24h后,各实验组不同浓度的布比卡因对SH-SY5Y细胞活力均有明显影响,细胞活力明显下降,且随剂量增加,细胞活力下降明显增加。Bupi0.5～Bupi2.5组细胞活力分别下降至82%、70%、53%、43%和25%。各实验组细胞在布比卡因处理后细胞凋亡率明显增加,且随着浓度的增加,细胞凋亡率也明显增加。Bup0.5～Bup2.5组细胞凋亡率分别为20%、26%、37%51%和62%。0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mM。结论布比卡因对SH-SY5Y细胞有损伤作用,且随浓度的增加,损伤程度加重。在本实验中,我们测得布比卡因LD50为1.477 mM,所以我们选择1.5mM布比卡因建立SH-SY5Y细胞损伤模型。第2章姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用目的确定对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用的姜黄素浓度。方法体外培养SHSY5Y细胞,分为12组,C组为对照组(未经药物处理),Bup组(各组Bup浓度均为1.5mM),Bup+Cur0.5组,Bup+Cur1.0组, Bup+Cur2.0组,Bup+Cur5组,Bup+Cur10组(在布比卡因培养液处理细胞之前加入姜黄素处理24h),Curo.5组,Curl.o组,Cur2.o组,Cur5组,Cur1o组(仅加入姜黄素处理24h)。观察细胞形态,采用MTT法检测细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡,确定布姜黄素对布比卡因神经毒性的保护作用,并确定有保护作用的姜黄素浓度。统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。组内比较采用重复测量设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。结果姜黄素预处理24h后,对各实验组SH-SY5Y细胞活力均有明显影响。Bup+CuT0.5～Bup+Cur10组细胞活力分别为70%,90%,75%,60%,52%。Cur0.5～Cur10组细胞活力分别为98%,99%,85%,65%,58%。对照组、Cur1.0组、Bup组和Bup+Cur10组细胞凋亡率分别为10%,11%,32%和20%。与Bup组比较,Bup+Cur1.0组细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义。结论1 μM和2μM的姜黄素预处理24h后明显减轻布比卡因导致的细胞活力降低,5μM和10 μM的姜黄素没有细胞保护作用。而且1 μM和2 μM的姜黄素的神经保护作用无统计学差异。但与对照组比较,姜黄素浓度为2μM时细胞毒性明显增加,所以我们确定姜黄素对布比卡因神经毒性有保护作用,并选择姜黄素浓度为1μM进行后续的实验。第3章Akt信号通路在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用目的探讨Akt信号通路是否与姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用有关。方法体外培养SHSY5Y细胞,分为6组,C组为对照组(未经药物处理),Bup组,Cur组,Bup+Cur组,Bup+Tri组,Bup+Cur+Tri组(在布比卡因培养液予以Akt特异性阻断剂triciribine 1μM处理30min,再入姜黄素处理布比卡因培养液24h)。采用流式细胞仪检测细胞ROS水平和线粒体膜电位、TUNEL检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、 caspase-9表达水平,检测PRDX3蛋白表达水平和mRNA水平,并进行了PRDX3免疫荧光检测。统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。组内比较采用重复测量设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。结果姜黄素预处理24h后,布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤减轻。Bup组p-Akt/Akt约为0.3,与Bup+Cur组比较,明显降低；Bup组Bcl-2/Bax值约为0.55,与Bup+Cur组比较,明显降低；Bup组Casepase-9/GAPDH约为1.8,与Bup+Cur组比较,明显升高降低。与Bup+Cur组比较,Bup+Cur+Tri组p-Akt/Akt值约为0.6,明显降低;Bup+Cur+Tri组Bcl-2/Bax值约为0.6,显著降低；Bup+Cur+Tri组Casepase-9/GAPDH约为2.1,显著升高。与Bup组比较,Bup+Cur组线粒体ROS水平明显降低；与Bup+Cur组比较,Bup+Cur+Tri组线粒体ROS水平明显升高。与C组比较,Bup组和Bup+Tri组PRDX3蛋白表达水平和mRNA水平均明显降低,差异有统计学意义；与Bup组比较,Bup+Cur组PRDX3蛋白表达水平和mRNA水平明显升高,差异有统计学意义；与Bup+Cur组比较,Bup+Cur+Tri组PRDX3表达蛋白水平和mRNA水平明显降低,差异有统计学意义。结论Akt信号通路的激活与姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤有关。第4章PRDX3蛋白在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的作用目的探讨姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用是否与增强抗氧化蛋白PRDX3有关方法采用小干扰mRNA技术培养Prdx3siRNA转染细胞,分为3组,Prdx3siRNA转染细胞(对照组C组)、Prdx3siRNA转染细胞+Bup组(Bup组),Cur+Prdx3siRNA细胞+Bup (Bup+Cur组)。Cur组加入加入姜黄素处理24h,除去姜黄素后再加入1.5mM布比卡因24h。采用TUNEL检测细胞凋亡、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PRDX3> Bcl-2, Bax和caspase-9蛋白表达水平,q-PCR检测PRDX3mRNA表达水平。统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。组内比较采用重复测量设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。结果与C组比较,Bup组PRDX3表达明显减少,差异有统计学意义,Bup+Cur组PRDX3表达略有减少,差异无统计学意义；与C组比较,Bup组Bax蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义,Bup+Cur组蛋白表达水平略有减少,差异无统计学意义；与C组比较,Bup组Bcl-2蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义,Bup+Cur组蛋白表达水平略有减少,差异无统计学意义；与C组比较,Bup组caspase-9蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义,Bup+Cur组蛋白表达水平略有减少,差异无统计学意义。结论 姜黄素对布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用与抗氧化蛋白PRDX3表达水平增强有关。