【摘 要】
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背景:血管内皮细胞损伤是多种疾病的重要病理生理特征。内皮细胞焦亡是引起多种疾病内皮功能障碍的新原因。神经酰胺在脓毒症、急性肺损伤、急性心肌梗塞等疾病中作为潜在的炎症生物活性介质,增加血管内皮的通透性。神经酰胺也参与了多种生物学效应,如细胞的凋亡、增殖、分化等,但是否可通过诱导细胞焦亡加重血管内皮损伤尚不清楚。本研究探讨神经酰胺是否能诱导焦亡及其可能的作用机制。方法:1.使用cck-8法测定人脐静脉
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背景:血管内皮细胞损伤是多种疾病的重要病理生理特征。内皮细胞焦亡是引起多种疾病内皮功能障碍的新原因。神经酰胺在脓毒症、急性肺损伤、急性心肌梗塞等疾病中作为潜在的炎症生物活性介质,增加血管内皮的通透性。神经酰胺也参与了多种生物学效应,如细胞的凋亡、增殖、分化等,但是否可通过诱导细胞焦亡加重血管内皮损伤尚不清楚。本研究探讨神经酰胺是否能诱导焦亡及其可能的作用机制。方法:1.使用cck-8法测定人脐静脉血管内皮细胞暴露在不同浓度的神经酰胺（0、10、20、30、40、50、60μmol/L）下12小时,24小时,48小时的生存率。2.不同浓度的维拉帕米（0、10、20、40、60、80、100μmol/L）处理人脐静脉血管内皮细胞12小时后,使用cck-8试剂盒来测定细胞的活力,从而筛选出合适的维拉帕米的浓度用于后续实验。3.将细胞分为control、control si-RNA、TXNIP si RNA组,采用逆转录-聚合酶链反应技术和蛋白免疫印迹法检测si-RNA对TXNIP表达的影响。4.将细胞分为0μmol/L ceramide、5μmol/L ceramide、10μmol/L ceramide、20μmol/L ceramide、control、20μmol/L ceramide、20μmol/L ceramide+20μmol/L verapamil、20μmol/L verapamil和20μmol/L ceramide+TXNIP si-RNA组.随后不同组的细胞都处理12小时,然后使用逆转录-聚合酶链反应技术检测TXNIP、NLRP3、caspase-1和GSDMD基因的表达,采用蛋白免疫法检测TXNIP、NLRP3、caspase-1、Casp1-P20、GSDMD、GSDMD-NT蛋白的表达。5.将细胞以合适的密度种于六孔板中,并在在药物处理12小时后用收集上清,检测上清中的LDH的释放水平以及IL-1β跟IL-18的水平,并收集细胞,使用流式细胞术和Hoechst33342/pi双染试剂盒检测PI染色阳性的细胞。6.不同组的细胞进行相应的处理后,使用caspase-1活性检测试剂盒检测caspase-1的活性,并采用FITC法检测内皮细胞的通透性。结果:1.人脐静脉血管内皮细胞的活力随着神经酰胺浓度的增加以及时间的推移而逐渐的降低,当神经酰胺浓度在20μmol/L并处理12小时的情况下与对照组相比细胞的活力在65%左右,因而我们将神经酰胺浓度为20μmol/L,处理时间12小时做为最佳的实验条件,同样的当维拉帕米的浓度在0-20μmol/L时,细胞活力无明显的影响,因而我们选择维拉帕米浓度20μmol/L做为后续的预处理浓度。2.si-RNA降低了TXNIP基因和蛋白质的表达。3.随着神经酰胺处理浓度的增加,TXNIP、NLRP3、caspase-1、GSDMD的基因表达增加（P＜0.05）,同时TXNIP、NLRP3、caspase-1、Casp1 P20、GSDMD、GSDMD-NT蛋白表达水平上调（P＜0.05）。当维拉帕米或者si-TXNIP和神经酰胺共孵育处理后,相较于神经酰胺组,TXNIP、NLRP3、caspase-1、GSDMD的基因表达水平下调（P＜0.05）,同时TXNIP、NLRP3、caspase-1、Casp1 P20、GSDMD、GSDMD-NT蛋白表达水平下降（P＜0.05）。4.伴随着神经酰胺处理浓度的增加,上清中LDH、IL-1β跟IL-18的释放量增加（P＜0.05）,PI阳性染色的细胞上调（P＜0.05）。而当给与维拉帕米或者si-TXNIP后,上清中LDH、IL-1β跟IL-18的释放量减少（P＜0.05）,流式实验和Hoechst33342/pi染色结果也表明了阳性染色细胞数的下降（P＜0.05）。5.给与不同浓度的神经酰胺处理后,caspase-1的活性也逐步增加,内皮细胞的通透系数百分比与正常对照组相比也逐渐增高（P＜0.05）,而维拉帕米或者si-TXNIP降低了caspase-1的活性,也降低了内皮细胞的通透性（P＜0.05）。结论:外源性给与神经酰胺可以促进人脐静脉血管内皮细胞发生焦亡,增加内皮细胞的通透性。与此同时,TXNIP-NLRP3-GSDMD通路在其中扮演了重要的作用。而抑制TXNIP的表达可以减轻细胞焦亡的发生,改善血管内皮的通透性。
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