论文部分内容阅读
蛹虫草是一种著名的食药两用真菌,含有多种对人体有益的生物活性成分,已成为科学家们研究的热点。近年来研究发现蛹虫草含有亲水性更强的新型类胡萝卜素,具有广阔的应用领域和市场前景,但由于其含量低,并不能满足日益增长的市场需求,究其原因是功能基因和生物合成途径未知,严重限制了蛹虫草的推广应用。因此,从分子层面挖掘色素合成相关基因、鉴定基因功能、解析生物合成途径,在此研究基础上有目的地改造蛹虫草菌株,培育高产色素的工程菌株、或构建异源表达工程菌株,这将有利于从根本上解决蛹虫草色素含量低的难题。本文首先通过转录组测序和生物信息学分析,挖掘了色素合成相关基因（CCM＿04119,即Cm Tns;CCM＿05119,即Cm Fhp;CCM＿07824,即Cm Mox;CCM＿08296,即Cm Hyp）。研究上述基因功能需要完整的分子遗传操作体系,蛹虫草基因组的测序完成,使反向遗传操作系统的优势凸显,因此,本文以Cm Tns作为靶基因,旨在建立高效的蛹虫草反向遗传操作体系（基因敲除和基因回补）,为研究蛹虫草基因功能提供有力工具。其次,采用本文建立的反向遗传操作系统研究了Cm Tns、Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因的功能。最后,从蛹虫草基因组中挖掘了八氢番茄红素合成酶基因（Psy）,通过基因替换方法研究其功能。本文的主要研究结果如下:（1）对蛹虫草的3个菌丝样品（CM10＿WD、CM10＿WL、CM10＿RL）进行了转录组测序和生物信息学分析。结果表明,不同培养基的样品（CM10＿RL vs CM10＿WL）之间有936个（318个上调、618个下调）差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）,不同光照培养的样品（CM10＿WD vs CM10＿WL）之间有1722个DEG（866个上调、856个下调）。蛹虫草转录本与KEGG pathway数据库中的类胡萝卜素生物合成途径比对结果表明CCM＿06728和CCM＿09155基因参与类胡萝卜素的生物合成。通过生物信息学分析,挖掘出4个可能与蛹虫草黄色素合成相关的基因（Cm Tns、Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp）。（2）通过荧光染色和显微观察,首次确定了蛹虫草的分生孢子、芽生孢子和菌丝均为单核细胞。（3）以蛹虫草菌丝为材料,优化单核原生质体的制备条件,最适条件为:2.00%裂解酶（1.00%lysing enzyme和1.00%lywallzyme）、渗透压稳定剂为0.8 mol/L KCl、酶解温度为32℃、酶解液p H值为6.5、酶解时间为3.0 h、菌丝菌龄为4 d,在此最适条件下,原生质体的产率达到了2.25×107个/g鲜菌丝。再生培养基中的最适渗透压稳定剂为1.0 mol/L的山梨醇,可使原生质体的再生率达到36.5%。（4）建立了蛹虫草的基因敲除系统,首次把split-marker方法成功应用于蛹虫草。草铵膦适合作为蛹虫草的筛选抑制剂,300μg/m L的草铵膦可完全抑制蛹虫草原生质体的生长。构建了含有bar基因表达盒的载体p CAMBIA0390-Bar和Cm Tns基因的敲除载体p CAMBIA0390-Bar-KOTns。采用PCR方法制备了Cm Tns基因的split-marker敲除载体和线性敲除载体,通过PEG介导转化蛹虫草单核原生质体,成功敲除了蛹虫草Cm Tns基因,且split-marker敲除载体的敲除率比线性敲除载体的敲除率高。bar基因在Cm Tns基因敲除株（ΔCm Tns）中可稳定遗传。（5）建立了蛹虫草的基因回补系统。苯菌灵适合作为蛹虫草的筛选抑制剂,2μg/m L的苯菌灵可完全抑制蛹虫草分生孢子的生长。构建了含有ben基因表达盒的载体p CAMBIA0390-Ben和含有Cm Tns基因表达盒的载体p CAMBIA0390-Ben-Com Tns。PEG介导转化法和农杆菌介导转化法均可实现Cm Tns基因的回补,但农杆菌介导转化法的回补效果更好。（6）通过构建Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因的敲除载体（p CAMBIA0390-Bar-KOFhp、p CAMBIA0390-Bar-KOMox、p CAMBIA0390-Bar-KOHyp）和制备split-marker敲除载体,成功敲除了Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因,并获得了敲除株ΔCm Fhp、ΔCm Mox、ΔCm Hyp。（7）构建了Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因的回补载体（p CAMBIA0390-Ben-Com Fhp、p CAMBIA0390-Ben-Com Mox、p CAMBIA0390-Ben-Com Hyp）,通过农杆菌介导转化法成功把Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因的表达盒分别回补入了ΔCm Fhp、ΔCm Mox、ΔCm Hyp菌株的基因组,获得了回补菌株Com Fhp、Com Mox和Com Hyp。（8）表型分析结果表明,敲除Cm Tns、Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因均会使蛹虫草的颜色表型变浅、类胡萝卜素含量降低,同时也会使蛹虫草的分生孢子产量降低。此外,Cm Tns基因的缺失会导致子实体数量减少、体积变小、菌丝末端膨大且弯曲,Cm Fhp、Cm Mox、Cm Hyp基因的缺失均导致敲除菌株不产子实体。（9）从蛹虫草基因组中挖掘到八氢番茄红素合成酶基因（Psy）,克隆Psy基因并替换质粒p AC-BETA上的crt B基因,获得了基因替换菌株Top10-p AC-BETA-Psy,经HPLC检测分析,未检测到β-胡萝卜素,表明蛹虫草Psy基因在大肠杆菌中不能把GGPP（Geranylgeranyl diphosphate）转化成八氢番茄红素。