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Rheb(Ras homolog enriched in brain)是小G蛋白Ras的同源蛋白,在功能上具有相似性,即具有GTP酶的活性。Rheb在体内有两种存在方式,与GDP结合的方式(GDP-Rheb)和与GTP结合的方式(GTP-Rheb),后者才具有相应的生物学活性。Rheb可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)来调控多种生物学活动,比如存活、生长、增殖、再生、能量代谢、氧化应激等。然而最近有研究报道称,mTOR被过度激活后,可以抑制脂肪分解、促进脂肪生成和储存,而抑制mTOR活性后,可以明显减低体脂含量并抵抗高脂饮食诱导的肥胖。因为Rheb是mTOR上游的调节蛋白,并且通过mTOR来实现其功能,所以我们想阐明在mTOR调节脂肪生成的过程中,Rheb是否也同样起到了调节作用。为此我们构建了Rheb的重组质粒(pCAG-Insulator-Rheb),并将其注射到B6小鼠的胚胎内,产生全身高表达Rheb的转基因小鼠。然后提取转基因阳性小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblast cells, MEFs),进行诱导分化。然后通过检测MEFs内甘油三酯的含量、检测脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达情况,来观察Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用。在本实验中,我们观察到高表达Rheb后,可以促进MEFs内脂滴的生成,甘油三酯含量明显增高,油红O染色(Oil Red O Stain)有明显区别,并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均明显升高。由此,我们得出结论:Rheb过表达以后确实可以促进脂肪细胞的分化。而Rheb促进脂肪细胞分化的作用也很可能是通过过度激活mTOR来实现的,进一步观察mTOR下游的靶蛋白如S6K、S6的磷酸化表达水平可能为这一现象提供合理的解释。该实验为进一步阐明脂肪细胞分化的调控机制提供新的理论,同时给临床防治肥胖带来新的契机。在体内,FKBP38可以与mTOR直接结合起到抑制mTOR活性的作用,这个效果类似于Rapamycin-FKBP12复合物的作用,因此FKBP38被认为是mTOR的内源性抑制剂,其活性不需要辅助条件的参与。然而,FKBP38又同时能与GTP-Rheb结合,从而释放其对mTOR的抑制作用。但是对于FKBP38对mTOR的调控作用,目前并没有达到统一的认识,甚至得出了相反的结论。氨基酸作为经典的mTOR激活剂,似乎并没有参与FKBP38对mTOR活性的调节。但由于在mTOR信号通路中,FKBP38所在的位置特殊,在Rheb的下游、mTOR的上游,因此进一步了解FKBP38的生理功能也具有极为重要的意义。为此我们同样构建了FKBP38的重组质粒(pCAG-Insulator-FKBP38),并注射进B6小鼠胚胎产生全身高表达FKBP38的小鼠,进行成脂诱导分化,观察其在脂肪分化中所具有的调控作用。结果,与Rheb促进脂肪分化的效应相反,FKBP38过表达可以抑制脂肪细胞的分化。但其具体的调控机制还有待进一步实验证明。目的:(1)观察mTOR信号通路中上游调控蛋白Rheb对脂肪细胞分化的影响(2)观察mTOR信号通路中上游调控蛋白FKBP38对脂肪细胞分化的影响方法:(1)构建Rheb和FKBP38重组质粒并进行胚胎注射产生全身高表达的转基因小鼠。(2)用聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)法鉴定转基因小鼠的阴阳性和Rheb/FKBP38表达量高低。(3)提取转基因小鼠第13.5天胚胎成纤维细胞(MEFs)进行诱导分化。(4)在分化第12天进行油红O染色(Oil Red O),并测定细胞内甘油三酯的含量,再用实时定量PCR(Real Time-PCR)方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达情况。结果:(1)高表达Rheb后,可以促进MEFs内脂滴的生成,甘油三酯含量明显增高(P<0.05),油红O染色(Oil Red O Stain)有明显区别,并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均明显升高(P<0.05)。(2)高表达FKBP38后,可以抑制MEFs内脂滴的生成,甘油三酯含量明显降低(P<0.05),油红O染色(Oil Red O Stain)有明显区别,并且脂肪细胞特异性转录因子PPARγ和C/EBPα的表达量均明显降低(P<0.05)。结论:(1)Rheb可以促进脂肪细胞的分化。(2)FKBP38可以抑制脂肪细胞的分化。