前言:天然免疫曾经被认为是机体免疫系统应答外界刺激的低级形式,但目前研究表明天然免疫反应不仅能够直接而快速对抗外界刺激,而且还对机体的获得性免疫反应起直接的激活和导向作用。抗菌肽是生物体天然免疫反应的重要因子,它不仅能够直接杀伤入侵的病原微生物,中和有害的微生物产物,抑制病原微生物入侵靶细胞,而且,还可通过作用于多种白细胞亚群,加强抗原特异性T淋巴细胞及B淋巴细胞的活化等免疫调节功能而增强机体的应激能力,从而间接发挥保持机体内环境稳态的作用。目前,已有若干研究表明,抗菌肽的抗菌功能对生理条件下的盐离子浓度高度敏感,而且还可受到血清成分的直接抑制作用；而其免疫调节功能却不受生理条件下,生理浓度的盐离子及血清成分等因素的影响,因此,有人主张极有可能免疫调节功能才是抗菌肽的主要功能。防御素是抗菌肽中重要的一类,它普遍存在于高等生物,不仅对病原微生物具有广谱的毒杀效应,而且还具有重要的免疫调节活性。鼠源性β-防御素2(mBD2)是防御素中具有代表性的一种,研究表明,它可通过趋化因子受体CCR6趋化未成熟树突状细胞,并作为TLR4的内源性配体促进树突状细胞的成熟,产生一系列促炎症因子、趋化因子,上调共刺激分子表达。用编码非免疫原性淋巴瘤抗原与mBD2融合蛋白的DNA质粒免疫小鼠,可在小鼠体内诱发出明显的抗肿瘤活性。可见,mBD2作为天然免疫反应的组成部分,还可协助非免疫原性抗原在小鼠体内诱导出有效的特异性获得性免疫反应,是一种天然的免疫佐剂。mBD2是连接天然免疫反应和获得性免疫反应的桥梁,提示了一种新的肿瘤免疫治疗策略。利用mBD2能够增强抗原特异性免疫反应的特性,可研究开发以mBD2为基础的肿瘤疫苗。目前,尽管人类已经研究了多种免疫佐剂,但是除了铝制剂以外,大多数免疫佐剂都由于具有严重的毒副作用而不能够直接应用于人体；而铝制剂虽然可用,但是它的免疫增强活性有限,且倾向于引发TK2型免疫反应,因此具有很大的局限性。mBD2作为一种内源性天然活性物质,具有上述强烈的免疫调节活性,我们将mBD2应用于恶性黑色素瘤的免疫治疗,期望它能够克服目前铝制剂存在的局限性。恶性黑色素瘤简称“恶黑瘤”,是一种来源于黑色素细胞的恶性肿瘤,其恶性程度高、起病隐匿、误诊率高、预后很差,是全世界范围内发病率增长最快的恶性肿瘤之一。恶性黑色素瘤对一般的综合性治疗措施：如放疗、化疗都表现为耐受,早期恶黑瘤的治疗主要以手术为主,晚期恶黑瘤预后很差,尚无有效的治疗手段,主要以个体化的综合治疗为原则。由于恶性黑色素瘤是一种免疫原性很强的肿瘤,因此特异性免疫治疗一直以来都是恶性黑色素瘤治疗的重要手段之一。尽管免疫治疗在许多恶性黑色素瘤小鼠模型中都能够诱导出明显的抗肿瘤免疫保护作用,但临床实验的结果表明,人体对恶性黑色素瘤免疫治疗的反应率远远不如实验动物有效,仅10～30%。目前,还不清楚人体对恶性黑色素瘤免疫治疗产生个体差异的确切原因,但是,普遍认为疫苗的临床有效性不仅决定于其种类和制备方法,还取决于用于增强疫苗的有效性而选择的免疫佐剂。本文将防御素mBD2的免疫调节活性应用于恶性黑色素瘤的免疫治疗,制备mBD2基因修饰的恶性黑色素瘤细胞疫苗、观察其体内抗肿瘤免疫效果,并探讨其抗肿瘤免疫保护作用的机制。实验方法：1.采用RT-PCR技术从C57BL/6小鼠肾脏组织中扩增出小鼠β-防御素2(mBD2)成熟肽基因片段,采用overlap PCR方法将小鼠IgK信号肽序列加在mBD2成熟肽基因序列的5’端,T-A克隆后,构建含有IgK信号肽的mBD2分泌性真核表达载体pcDNA3.1(+)-IgK-mBD2,并通过PCR、酶切、测序等方法鉴定其正确性。2.采用脂质体转染法分别将空载体pcDNA3.1(+)及含有目的基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IgK-mBD2转染恶性黑色素瘤B16细胞,G418筛选后,获得稳定表达细胞株,分别命名为B16,p和B16-mBD2。RT-PCR从mRNA水平鉴定G418抗性基因neo基因的表达,从而证明pcDNA3.1(+)-IgK-mBD2和pcDNA3.1(+)等质粒的成功转染；RT-PCR从mRNA水平鉴定mBD2基因水平的表达；Western-Blot从蛋白水平鉴定mBD2分子的表达。3.采用MTT法测定三株细胞：B16、B16-p、B16-mBD2在120小时内的生长曲线；采用PI染色流式细胞术检测对数生长期三株细胞的细胞周期分布及凋亡情况；采用FITC标记的抗小鼠CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ等抗体染色,流式细胞术检测三株细胞上述CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ等相关分子的表达变化。4.采用辐射方法将三株细胞B16、B16-p、B16-mBD2制备成细胞疫苗,分别在C57BL/6小鼠体内进行免疫预防和免疫治疗动物实验。设立生理盐水对照组、B16对照组、B16-p对照组及B16-mBD2实验组。5.免疫预防实验：6～8周龄雌性C57BL/6小鼠,随机分成4组,每组10～12只,分别为生理盐水对照组、B16对照组、B16-p对照组和B16-mBD2实验组。各组所有动物,按照各自的分组,分别于左腋下皮下注射给予0.1mL生理盐水及106个辐射的B16、B16-p和B16-mBD2等细胞疫苗。各组动物免疫七天后,各组所有小鼠均给予5×104个对数生长期的野生型B16细胞致瘤,逐日观察各组小鼠生存状态、制作肿瘤体内生长曲线、进行生存期分析及HE染色观察各免疫预防组肿瘤组织及重要脏器,如：肝脏、肾脏、脾脏、肺脏等的组织学变化。6.免疫治疗实验：6～8周龄雌性C57BL/6小鼠,随机分成4组,每组10～12只,分别为生理盐水对照组、B16对照组、B16-p对照组和B16-mBD2实验组.,各组所有动物分别于左腋下皮下注射给予105个对数生长期野生型B16细胞致瘤,同时各组所有小鼠按照各自的分组,于同一天开始,左腋下皮下注射分别给予O.1mL生理盐水及106个辐射的B16、B16-p和B16-mBD2等细胞疫苗进行治疗,每周两次,连续两周。逐日观察各组小鼠生存状态、制作肿瘤体内生长曲线、进行生存期分析及HE染色观察各免疫治疗组肿瘤组织及重要脏器,如：肝脏、肾脏、脾脏、肺脏等的组织学变化。7.采用ELISA方法测定B16、B16-p和B16-mBD2等细胞疫苗免疫小鼠后,各组小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ,、IL-12、IL-4等含量的变化；采用非放射性细胞毒性分析方法测定B16、B16-p和B16-mBD2等细胞疫苗免疫小鼠后,各组小鼠NK细胞杀伤活性及CTL细胞杀伤活性。8.采用SPSS 13.0进行统计学分析。细胞生长曲线、动物实验中的肿瘤体内生长曲线等采用重复测量因素的方差分析；细胞周期分布、凋亡率、细胞膜表面免疫相关分子的表达变化等采用单向方差分析；方差齐性时,多重比较采用LSD法,方差不齐时,多重比较采用Dunnett T3法。CTL细胞杀伤活性、NK细胞杀伤活性等采用析因设计,运用单因素方差检验(one-way ANOVA)LSD法进行数据分析。P<0.05表示有统计学意义。实验结果：1.成功构建含有鼠源性IgK信号肽序列的mBD2真核分泌性表达载体pcDNA3.1(+)-IgK-mBD2,并鉴定正确。2.pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1(+)-IgK-mBD2等载体转染B16细胞后,G418筛选得到稳定表达细胞株,分别命名为B16-p和B16-mBD2。3.细胞生长曲线实验证实,与野生型B16细胞及B16-p相比较,B16-mBD2细胞的增殖速度显著减慢(F=144.256,P<0.05)；与野生型B16细胞相比较,B16-p的增殖速度没有显著变化。4.流式细胞仪检测结果显示,接种24小时后,与对数生长期的野生型B16细胞及B16-p相比较,对数生长期的B16-mBD2细胞的细胞周期发生S期轻度阻滞(F=8.952,P<0.05)；三株细胞B16、B16-p和B16-mBD2的细胞膜表面分子CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ等表达没有显著性差异。5.在免疫预防实验中,生理盐水对照组、B16对照组、B16-p对照组所有小鼠在49天内全部死亡,组间没有显著性差异,中位生存期分别为35天、37天、33天；而B16-mBD2免疫预防组小鼠肿瘤体内生长速度显著缓慢(F=118.387,P<0.05),小鼠生存期显著延长(X2=18.857,P<0.05),中位生存期为55天,同期生存状态比其他各个对照组明显良好。至实验结束,即致瘤后第150天为止,仍有37.5%的小鼠实现无瘤生存。6.在免疫治疗实验中,生理盐水对照组、B16对照组及B16-p对照组所有小鼠均在44天内全部死亡,组间没有显著性差异,中位生存期分别为32天、34天、31天；B16-mBD2免疫治疗组小鼠肿瘤体内生长速度显著缓慢(F=289.615,P<0.05),小鼠生存期显著延长(X2=22.006,P<0.05),中位生存期为59天,同期生存状态比其他各个对照组明显良好。至实验结束,即致瘤后第150天为止,仍有25%的小鼠实现无瘤生存。7.在免疫预防和免疫治疗实验中,B16-mBD2疫苗免疫组均诱导淋巴细胞大量浸润到肿瘤组织,脾脏淋巴小结增多,生发中心反应性增生、增大。生理盐水对照组、B16对照组、B16-p对照组均不能诱导这种主动性抗肿瘤免疫反应。8.B16-mBD2细胞疫苗免疫后,可促进IFN-γ,产生显著增多(F=506.814,P<0.05),促进IL-12产生显著增多(F=83.637,P<0.05),与B16对照组、B16-p对照组比较差异有统计学意义,但对IL-4的含量没有影响。B16-mBD2细胞疫苗可诱导小鼠针对B16细胞的特异性CTL杀伤活性显著增强(F=44.376, P<0.05)、NK细胞杀伤活性显著增强(F=119.750,P<0.05),与B16对照组、B16-p对照组比较差异有统计学意义。9.B16-mBD2细胞疫苗免疫小鼠后,对小鼠的主要脏器如：肝脏、肾脏、脾脏、肺脏等的HE染色形态学观察显示,各个主要脏器未见明显的病理改变,提示B16-mBD2疫苗相对安全。结论：mBD2基因转染恶性黑色素瘤B16细胞后,制备的转基因细胞疫苗具有明显的抗小鼠恶性黑色素瘤B16效应,该疫苗免疫后,通过诱导小鼠NK细胞杀伤活性增强、CTL杀伤活性增强、促进IFN-γ、IL-12等Thl型细胞因子产生增加、诱导大量淋巴细胞浸润到肿瘤组织内部以及诱发小鼠脾脏淋巴小结增生、增大等多种机制发挥抗恶性黑色素瘤免疫保护作用,且安全无毒副作用。mBD2基因修饰的B16细胞疫苗免疫后对Th2型细胞因子IL-4的含量没有影响,提示该疫苗抗肿瘤免疫保护作用可能与Th2型免疫反应无关。总之,mBD2基因修饰的B16细胞疫苗能够同时激活天然免疫(NK细胞活性)和获得性免疫(CTL细胞杀伤活性)、肿瘤局部免疫(肿瘤组织内淋巴细胞浸润)和系统免疫(诱导IFN-γ、IL-12等细胞因子含量增高)来发挥抗恶性黑色素瘤作用,为恶性黑色素瘤的免疫治疗开拓了新的思路。