目的:　　为构建PET28a-H-FABP重组质粒,诱导表达及纯化该重组蛋白,以其为参考标准品来建立生物素-亲和素放大系统时间分辨荧光免疫分析(BA-TRFIA)检测H-FABP的新方法.BNP蛋白购自芬兰HyTest公司,以其为参考标准品来建立生物素-亲和素放大系统时间分辨荧光免疫分析(BA-TRFIA)检测BNP的新方法.　　方法:　　1.人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的可溶性原核表达、纯化　　先将 H-FABP 目的基因与载体 PET28a 连接,将构建成功的 PET28a-H-FABP重组质粒转化入感受态细胞 BL21 中,诱导表达并纯化重组蛋白 H-FABP,通过Western Blot进行鉴定.　　2. BA-TRFIA方法的建立　　将抗H-FABP和抗BNP的单克隆捕获抗体包被到固相板上,对检测抗体进行生物素标记,并对Eu3+进行链霉亲和素(SA)标记.采用双抗体夹心法,对包被捕获抗体浓度、生物素标记检测抗体用量、Eu3+-SA 用量进行优化以确定最佳反应条件,来初步建立BA-TRFIA检测H-FABP与BNP的新方法.　　3.方法学评价　　对BA-TRFIA检测H-FABP和BNP的方法进行以下方面评价:灵敏度、最低检测限、特异性和精密度.　　4.临床运用　　检测150例健康体检者血清中H-FABP和BNP水平,计算出参考值范围,同时使用本方法和化学发光免疫分析法(CLIA)检测H-FABP和BNP水平进行方法学比对.　　结果:　　1.人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的制备　　经PCR、双酶切及序列比对鉴定,成功构建了PET28a-H-FABP重组质粒,并诱导表达出重组蛋白H-FABP,经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定目的蛋白主要以上清的形式表达,分子量为 15KD.对菌液进行破菌后收集上清,并进行镍柱亲和层析纯化,经鉴定,纯化后的重组蛋白H-FABP能够与羊抗鼠H-FABP单抗特异性结合.　　2.BA-TRFIA方法的建立　　本课题成功将包被抗体共价偶联到固相板上,并成功对检测抗体进行生物素标记及对链霉亲和素SA进行Eu3+标记.由此得出H-FABP最佳反应条件为:包被抗体最佳浓度为 3μ g/ml,生物素化抗体最佳稀释度为 1:1600,Eu3+-SA 最佳稀释度为 1:500;BNP 最佳反应条件为:包被抗体最佳浓度为 3μ g/ml,生物素化抗体最佳稀释度为1:1600,Eu3+-SA最佳稀释度为1:4000.　　3.方法学评价　　利用该方法检测H-FABP的标准曲线工作范围为0.88-250ng/mL,剂量-反应线性相关系数为 0.9928,BNP 标准曲线工作范围为 1.22-480ng/mL,剂量-反应线性相关系数为0.9932.　　4.临床运用　　对150例临床健康体检者血清标本和150例病人血清标本进行检测,方法学比对结果显示两种方法具有较好的相关性.　　结论:　　本实验成功构建了PET28a-H-FABP重组质粒,实现了重组蛋白H-FABP高效表达.纯化后的 H-FABP 能够与羊抗鼠 H-FABP 单抗特异性结合,本室建立的BA-TRFIA 方法具有高灵敏度、高特异性和较宽的检测范围等优势,可以满足日常临床诊断要求,可初步用于检测人血清H-FABP和BNP.