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目的： 中耳炎(Otitis Media, OM)是儿童最常见的感染性疾病之一，具有高发病率和高复发率。呼吸道病毒流行时往往伴随肺炎、中耳炎的高发生率。许多儿童在罹患中耳炎之前都有上呼吸道病毒感染病史，A型流感病毒(Influenza A virus, IAV)是致OM的最主要呼吸道病毒之一，而肺炎链球菌( Streptococcus pneumoniae, S.pn)是致OM最主要的致病菌之一。流行病学调查、临床和实验研究都证实了先前的IAV呼吸道感染与OM的发生具有高度相关性。因此，建立IAV感染后继发S.pn感染性中耳炎（简称继发性中耳炎）小鼠模型对深入研究OM的发病机制具有重要的科学意义。 方法： 1.经鼻感染不同剂量H1N1甲型流感病毒PR8，感染后第5天听泡穿刺接种S.pn19F建立C57BL/6小鼠继发性中耳炎模型，观察小鼠体质量变化和生存率；于建模后不同时间点处死小鼠，制备中耳组织切片HE染色，收集中耳灌洗液进行细胞及细菌计数。通过比较继发性中耳炎与单纯中耳炎免疫应答反应的差异探索继发性中耳炎小鼠模型的合适PR8和S.pn剂量。 2. WT和TNF-α-/-鼠先经鼻感染550 TCID50流感病毒PR8后，第5天听泡穿刺接种106 CFU S.pn19F建立C57BL/6小鼠继发感染中耳炎模型，检测中耳灌洗液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和杀菌物质一氧化氮（Nitric oxide, NO）的水平，初步探索PR8在继发性中耳炎中的作用。 3.建立WT和TNF-α-/-鼠继发性中耳炎模型，观察WT和TNF-α-/-鼠体质量变化和生存率、计数中耳灌洗液细菌载量、制备中耳组织切片HE染色明确TNF-α在继发性中耳炎小鼠模型中的作用。 结果： 1. PR8预感染可导致S.pn感染性中耳炎小鼠死亡，而单纯S.pn感染组无一例死亡，小鼠体质量变化及生存率与病毒剂量呈剂量依赖方式；PR8感染后继发S.pn感染组中耳腔炎症细胞浸润明显多于单纯S.pn感染组，且细菌载量明显增加；当PR8的剂量为550 TCID50和S.pn为106 CFU时PR8+S.pn的生存率为80%，与单纯S.pn相比差异无显著性，故可作为继发性中耳炎的合适剂量，表明成功建立了继发性中耳炎。 2.与单纯S.pn感染组比，PR8+S.pn组TNF-α、NO显著增加，而IL-1β显著降低；IL-6、IFN-γ差异无统计学意义。TNF-α介导了NO的产生，与单纯S.pn组相比，PR8+S.pn组高水平的TNF-α在OM早期加重了中耳组织损伤。 3. TNF-α-/-后PR8+S.pn组小鼠死亡率明显增加；TNF-α-/-抑制中耳及肺对S.pn的清除；TNF-α-/-加重了继发性中耳炎中耳及肺损伤，TNF-α-/-对中耳MPO的产生没有明显影响而肺组织中MPO的产生减少。 结论： 本研究成功建立了继发性中耳炎C57BL/6小鼠模型，阐明在继发性中耳炎中，尽管过多的TNF-α产生会导致早期中耳组织损伤加重，但就OM的整个过程而言TNF-α仍然以发挥免疫保护作用为主。