研究背景艾滋病,亦称为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）,是一种由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的具有极大危害性的传染病。近年来,艾滋病有呈现持续增长的趋势,在全球日益流行,并严重威胁人类生命安全,已经成为严重的公共卫生和社会问题。随着社会的进步,人们对于艾滋病治疗策略和手段的研究有了更深入的了解。高效联合抗逆转录病毒治疗（HAART）是目前治疗艾滋病最有效的治疗手段,它可以有效控制病毒在人体内的复制,降低HIV-1感染者外周血病毒载量,升高CD4+T淋巴细胞水平,使艾滋病患者重建免疫功能,减少机会性感染和肿瘤等疾病的发生,极大地改善患者的预后。但是,由于艾滋病患者依从性及病毒耐药突变等问题,特别是患者体内HIV-1病毒储存库的持续存在,一旦停止抗病毒治疗,病毒储存库中整合到宿主基因组的前病毒DNA被激活,HIV-1病毒将会在3-4周内出现反弹,从而导致抗病毒治疗失败。所以HIV-1病毒储存库是目前艾滋病治愈的最主要的障碍,如何准确检测以及清除HIV-1病毒储存库是研究HIV-1的热点和难点。HIV-1病毒储存库是指在机体免疫应答反应和抗病毒治疗下,HIV-1病毒潜藏的细胞场所和解剖场所,它的特点具有稳定整合,不表达,停药后激活并产生新的病毒。静息型记忆性CD4+T淋巴细胞是HIV-1病毒储存库潜伏的主要场所,HIV-1病毒储存库的持续存在是至今还无法实现抗病毒治疗停药的最大障碍。早期确诊HIV-1感染对于尽早干预治疗及控制疾病进展至关重要,患者也可能因早期治疗而获益。HIV-1功能性治愈是指通过治疗手段使中断HARRT后的患者体内病毒储存库HIV-1 DNA抑制在检测水平之下,机体免疫功能基本正常的状态,这是临床上艾滋病患者治疗追求的目标,目前能够使HIV-1感染病人真正达到功能性治愈尚需要一段时间。本研究主要对HIV-1新发感染者是否存在HIV-1病毒储存库,及其与HIV-1慢性感染者是否存在差异,以及HAART治疗是否影响HIV-1病毒储存库等问题进行了较深入研究;另外,还对HIV-1病毒储存库与T淋巴细胞亚群及HIV-1病毒载量的相关性进行了分析研究。通过深入研究HIV-1感染者外周血淋巴细胞内HIV-1病毒储存库,为进一步探究HIV-1/AIDS疾病的功能性治愈提供实验依据。第一部分新发感染期HIV-1感染者外周血病毒储存库的研究研究目的分析HIV-1病毒储存库在新发感染者与慢性感染者两组间的变化情况,初步探究HIV-1感染时间对HIV-1感染者病毒储存库的影响研究方法本研究以广州市第八人民医院艾滋病住院病区或专科门诊就诊的HIV-1感染者为研究对象,均经HIV抗体确证实验室的免疫印迹实验（WB）确诊HIV-1型感染者,所有患者均未接受抗病毒治疗;运用抗体亲和力测定进行检测,即HIV-1限制性抗原亲和力酶联免疫方法（HIV-1 LAg-Avidityenzyme immunoassay,LAg-Avidit EIA）,LAg-Avidit EIA方法的原理是:人体在感染HIV-1后产生的HIV-1特异性抗体对相应抗原的识别和结合能力随着感染时间的延长而增加,即亲和力逐渐增加。从以上病例判定出HIV-1新发感染及慢性感染病例,其中筛选出HIV-1新发感染患者22例,HIV-1慢性感染患者22例;通过密度梯度离心法采集和分离所有患者的外周血单个核细胞（PBMC）,采用COBAS TaqMan全自动病毒载量检测系统检测患者外周血HIV-1 RNA,采用高敏感度实时荧光定量PCR方法检测所有患者淋巴细胞内HIV-1整合DNA（Alu-PCR方法）,采用流式细胞术检测患者血中的CD3+/CD4+/CD8+淋巴细胞数。使用SPSS16.0软件进行统计学分析,两组患者非正态分布计量资料以M(Q₂₅,Q₇₅)表示,采用Wilcoxon秩和检验;使用GraphPad Prism 5软件进行绘图;P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果新发感染组和慢性感染组外周血淋巴细胞内HIV-1整合DNA比较,慢性感染组患者外周血淋巴细胞内整合HIV-1 DNA量均远高于急性感染组患者外周血淋巴细胞内整合HIV-1 DNA量,差异有统计学意义（Z=-2.770,P=0.006）;在新发感染组患者中,CD4+T淋巴细胞数为258.50（139.25,373.25）cells/ul,CD8+T淋巴细胞数为1000.00（633.50,1921.75）cells/ul,CD4/CD8+T淋巴细胞比值为0.27（0.08,0.41）,HIV-1 RNA为6.7×10⁵（9.37×10⁴,1.39×10⁶）copies/ul;在慢性感染组患者中,CD4+T淋巴细胞数为57.50（18.50,231.75）cells/ul,CD8+T淋巴细胞数为699.50（344.25,782.25）cells/ul,CD4/CD8比值为0.09（0.05,0.32）,HIV-1 RNA容量为1.45×10⁵（5.89×10⁴,5.04×10⁵）copies/ul;两组患者CD4+T淋巴细胞数比较,差异有统计学意义（Z=-2.70,P=0.007）,两组患者CD8+T淋巴细胞数比较,差异有统计学意义（Z=-2.82,P=0.005）,两组患者CD4/CD8+T淋巴细胞比值比较,差异无统计学意义（Z=-1.69,P=0.091）,两组患者HIV-1 RNA比较,差异无统计学意义（Z=-1.69,P=0.091）。在新发感染组患者中,外周血淋巴细胞内HIV-1整合DNA与CD4+T淋巴细胞计数、CD8+T淋巴细胞计数、CD4/CD8+T淋巴细胞比值及HIV-1 RNA无相关性（r=-0.267、-0.026、-0.190、-0.169,P均>0.05）;在慢性感染组患者中,外周血淋巴细胞内HIV-1整合DNA与CD4+T淋巴细胞计数、CD8+T淋巴细胞计数、CD4/CD8+T淋巴细胞比值及HIV-1 RNA无相关性（r=0.291、0.133、0.113、0.114,P均>0.05）。在新发感染组内,HIV-1 RNA与CD4+T淋巴细胞计数、CD4/CD8+T淋巴细胞比值之间存在负相关（r=-0.478、-0.591,P=0.024、0.005）,与CD8+T淋巴细胞计数无相关性（r=-0.036、P=0.876）;在慢性感染组内,HIV-1 RNA与CD4+T淋巴细胞计数、CD4/CD8+T淋巴细胞比值之间存在负相关（r=-0.704、-0.615,P=0.001、0.004）,与CD8+T淋巴细胞计数无相关性（r=-0.296、P=0.205）。研究结论1.HIV-1新发感染患者外周血淋巴细胞内已存在HIV-1整合DNA,说明HIV-1病毒储存库在HIV-1感染早期已经建立;随着感染时间的延长,HIV-1病毒储存库容量增大。2.HIV-1新发感染患者的HIV-1病毒载量还处于较高水平,且此时机体T淋巴细胞免疫应答机制已开始启动。第二部分高效抗逆转录病毒治疗对HIV-1感染者外周血病毒储存库的影响研究目的观察HIV-1感染者外周血淋巴细胞亚群内HIV-1病毒储存库在接受高效抗逆转录病毒治疗前后的变化情况,为探究HIV-1/AIDS疾病的功能性治愈提供实验依据。研究方法本研究以广州市第八人民医院感染科或专科门诊就诊的HIV-1感染者为研究对象（21例未经HAART和22例经HAART的HIV-1感染者）,通过密度梯度离心法采集和分离所有患者的外周血单个核细胞（PBMC）,采用磁珠分选法分选出CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和非T淋巴细胞三类淋巴细胞亚群,采用COBAS TaqMan全自动病毒载量检测系统检测患者外周血HIV-1 RNA,采用高敏感度实时荧光定量PCR方法检测上述三类分选后淋巴细胞亚群内HIV-1整合DNA（Alu-PCR方法）,采用流式细胞术检测患者血中的CD3+/CD4+/CD8+淋巴细胞数。使用SPSS16.0软件进行统计学分析,两组患者非正态分布计量资料以M(Q₂₅,Q₇₅)表示,采用Wilcoxon秩和检验;使用GraphPad Prism 5软件进行绘图;P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果在未经HAART与经HAART两组组内比较,CD4+T淋巴细胞内HIV-1整合DNA量均远高于CD8+T淋巴细胞和非T淋巴细胞内HIV-1整合DNA量,差异有统计学意义（Z=-5.549、-5.547、-5.360、-5.493,P均<0.000）;未经HAART与经HAART两组比较,非T淋巴细胞中HIV-1整合DNA比较差异有统计学意义（Z=-3.326,P=0.001）,CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中HIV-1整合DNA比较差异均无统计学意义（Z=-1.871、-1.360,P=0.061、0.174）;未经HAART患者CD4+T淋巴细胞中HIV-1整合DNA与外周血HIV-1 RNA水平呈正相关（r=0.594,P=0.005）,与CD4细胞数和CD4/CD8比值呈负相关（r=-0.547、-0.482,P=0.010、0.027）,与CD8细胞数无相关性（r=-0.102,P=0.668）;未经HAART患者CD8+T淋巴细胞和非T淋巴细胞中HIV-1整合DNA与外周血HIV-1 RNA、CD4细胞数、CD8细胞数和CD4/CD8比值均无相关性（r=0.281、0.043、0.134、0.145,P均>0.05;r=0.274、0.218、-0.015、0.041,P均>0.05）;经HAART患者淋巴细胞亚群中HIV-1整合DNA与CD4细胞数、CD8细胞数和CD4/CD8比值均无相关性（r=-0.042、-0.333、0.208,P均>0.05;r=0.167、0.002、0.024,P均>0.05;r=0.078、0.216、0.261,P均>0.05）。研究结论1.HIV-1感染者的外周血淋巴细胞中,HIV-1病毒储存库主要存在于CD4+T淋巴细胞,少量存在于CD8+T淋巴细胞和非T淋巴细胞。2.接受HAART可能并不能有效减小T淋巴细胞中HIV-1病毒储存库。