研究背景:肝癌作为全球癌症发病率第6位,死亡率第2位的恶性肿瘤,一直在临床治疗和科学研究中备受关注。尽管早期肝癌可以通过肿瘤切除、肝脏移植等外科方式治疗,并且预后良好。但由于我国人民的生活饮食习惯不好以及对定期体检的忽视,肝癌患者数量逐渐增加,大多数肝癌患者发现时已经发展到中晚期,患者身体状况差,不能手术,无法行根治性切除;而且肝脏本身的血管丰富,术后也容易复发和转移;还有的患者在检出肝癌时发生各种转移,这一系列的原因导致肝癌患者的5年生存率只有12.1%。所以,临床上目前对于早期肝癌行根治性切除,但对于晚期肝癌或者不可手术肝癌则考虑通过化疗、放疗、介入治疗、免疫治疗以及靶向治疗等方式转化或降期为可手术肝癌,来提高患者生存率。铁死亡是一种很早就被发现但直到2012年才重新归类并命名的一种细胞死亡类型,与传统观念上的细胞凋亡不同,铁死亡被认为是细胞内铁过度积累使脂质过氧化物增多从而导致的细胞死亡。顺铂（DDP）是肝癌化疗治疗中常用的药物之一,但临床上无法通过增加顺铂剂量来提高肝癌患者化疗疗效,并且大剂量使用顺铂通常伴随着严重的不良反应。因此,开发能够应用于肝癌临床治疗的新的化疗方案意义重大。近年来研究发现铁死亡与DDP治疗癌症的作用机制密切相关,DDP可以使细胞产生大量的活性氧（ROS）,破坏细胞内的氧化应激平衡,促进胞内脂质过氧化,诱导细胞发生铁死亡。除此之外,目前对于铁死亡与肿瘤上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）之间的关联研究也愈发密切,而Snail2是在多种肿瘤发生EMT过程中起着重要作用的转录因子。我们之前的研究证明在肝癌中,Snail2可募集多种组蛋白修饰酶到E-钙粘蛋白的启动子区域,通过表观遗传学修饰抑制E-钙粘蛋白的表达,从而诱发EMT现象,促进了肿瘤侵袭转移过程。在我们的前期实验中,通过RNA干扰技术（RNAi）特异性地剔除或降低Snail2的表达,可以有效地抑制肿瘤细胞在体内和体外的侵袭转移。通过合理应用铁死亡与DDP之间的密切关系,我们设计出了一种基于纳米交联氧化铁（CLIO-NH2）与改进转染试剂PEI后生成的Polyethylenimine-NH2（PEN）组合,形成载体CNP,与此同时搭载可以抑制肝癌细胞发生转移的si Snail2,组成CNP@si Snail2与DDP联合化疗,诱导肝癌细胞发生铁死亡,并在杀伤肝癌细胞的同时,通过si Snail2抑制肿瘤细胞的EMT现象,抑制或减弱肝癌细胞的转移,通过集中消灭肝癌细胞,从而达到将不可手术肝癌转化或降期为可手术肝癌的目的。目的:通过设计一种以纳米铁复合物CNP为载体,搭载si Snail2,与低剂量的DDP联用,能在诱发肝癌细胞发生铁死亡的同时,尽可能的抑制肝癌细胞的转移,以期望能降低晚期肝癌的分期,提高患者的手术机会。方法:⑴制备载体CNP:采用不同质量比的60nm CLIO-NH2与PEN-25K交联,通过37℃的水浴超声,并在超高速离心分离之后,获得载体CNP。检测合成的载体CNP的粒径大小与电位高低,并且分别检测不同质量比制备的载体CNP的进入细胞能力与搭载si Snail2能力,根据检测结果选择合适的质量比。⑵检测载体CNP的细胞毒性:使用不同浓度的载体CNP,对肝癌细胞进行杀伤实验,通过CCK8检测。根据检测的结果,选择最佳的使用浓度。并通过细胞死亡抑制剂的检测、电镜观察、流式细胞术确认载体CNP诱发的细胞死亡过程是铁死亡。⑶检测载体CNP与DDP的联用效果:先通过CCK8实验测量DDP的IC10浓度,确定DDP的最佳使用浓度,然后通过镜下观察、CCK8、ROS检测、流式检测等手段,确认载体CNP与DDP的联用可以促进细胞的铁死亡。⑷验证CNP@si Snail2与DDP联用在体内的杀伤效果:构建BALB/c小白鼠的肝癌原位肿瘤模型,并且通过尾静脉将CNP@si Snail2与DDP的混合液注射入小鼠体内,在治疗16天后检查肿瘤大小。⑸检测CNP@si Snail2与DDP联用在体内的影响:通过检测肝功、免疫组化,来判断联合用药对个体的毒性;通过细胞死亡相关的免疫组化来判断肿瘤内的细胞死亡发生状况;通过RT-q PCR与免疫组化检测肿瘤组织的迁移状况。结果:⑴当采用质量比为1:1的60nm CLIO-NH2与PEN-25K交联时,合成的载体CNP能稳定地进入细胞,并且可搭载si Snail2,进入细胞能力与搭载si Snail2能力处在一个最佳的平衡状态。⑵不同浓度的载体CNP,对肝癌细胞的杀伤效果不同,通过CCK8检测,决定在CNP浓度为1μg/ml时进行CNP搭载si Snail2进入细胞效果的检测,以排除载体CNP细胞毒性的干扰;在CNP浓度为10μg/ml时进行各种细胞毒性试验,可以确认载体CNP可以诱发细胞铁死亡。⑶在CNP浓度为10μg/ml时,采用DDP的IC10浓度,二者联用对于肝癌细胞的杀伤效果强于二者单独使用,并且在此过程中,二者对细胞的铁死亡诱导效果也增加。⑷在BALB/c小白鼠的肝癌原位肿瘤模型中,可以明确看到CNP@si Snail2与DDP的联用组小鼠肿瘤更小,转移数量也更少,对体内原位模型治疗效果优异。⑸小鼠的肝功、免疫组化结果展示,确定CNP@si Snail2与DDP联用对个体的毒性并没有增加;细胞死亡相关的免疫组化结果展示CNP@si Snail2与DDP联用组内肿瘤组织内细胞死亡最多,尤其是铁死亡显著;通过RT-q PCR与免疫组化检测肿瘤组织,发现CNP@si Snail2与DDP联用组肿瘤的Snail2表达明显降低,肿瘤细胞迁移较少。结论:我们通过设计了一种以纳米交联氧化铁（CLIO-NH2,CN）与转染试剂Polyethylenimine-NH2（PEN）组合为载体CNP,更进一步地与低剂量的化疗药物顺铂（DDP）联用,在搭载si Snail2的同时,可以诱发细胞发生铁死亡,显著地诱导细胞死亡,抑制肝癌细胞生长,减弱肝癌细胞侵袭与转移。CNP@si Snail2可以稳定的进入肿瘤细胞内部,在细胞内溶酶体等细胞器的作用下,释放出si Snail2,干扰了肝癌细胞转移相关的基因表达;与此同时,被降解的CNP分解成单独的铁离子,大幅度提高了细胞内的铁浓度,产生大量的ROS,促进脂质过氧化,诱导细胞发生铁死亡。而与之联用的DDP,可以促进铁死亡这个过程,加强了对肝癌细胞的杀伤效果。本实验充分证明了这种联用可以有效的降低肝癌分期,抑制肝癌细胞转移,给患者提供了更多的治疗方案。通过这种联用,我们也可以看到,载体不仅仅可以只作为载体,也可以当作死亡诱导剂,发挥更大的作用,为纳米材料的应用提供进一步的可能,而未来也将可能出现更多的联合应用疗法。