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microRNAs(miRNA)是一类长约22核苷酸的非编码的单链RNA分子。它们参与细胞中各种基本生命过程的调控,包括发育、凋亡和细胞增殖,甚至是癌症发生。miRNA可以直接导致mRNA的降解或在转录后水平调控mRNA的翻译。miRNA let-7a-1的异常表达与肿瘤的发生密切相关。近来研究发现,miRNA let-7a-1在前列腺癌细胞中异常低表达,异源高表达miRNA let-7a-1能够有效地调控IGF-1R介导的信号通路,抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖,促进其凋亡。本研究开展了miRNA let-7a-1影响前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的分子机制研究。(1)首先构建miRNA let-7a-1真核表达载体pSilencer-let-7a-1,转染前列腺癌细胞PC-3细胞,利用RT-PCR检测该表达载体的表达效率。(2)构建miRNA let-7a-1靶序列-报道基因融合质粒pMIR-Report-let-7a-1T,荧光素酶报告基因系统检测了pre-1et-7a-1的表达及其成熟miRNA let-7a-1的作用,采用MTT比色法、流式细胞术和Hoechst33258细胞染色检测了miRNA let-7a-1对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响,进一步确定miRNA let-7a-1的表达及其生物学活性。(3)pSilencer-let-7a-1:转染前列腺癌细胞PC-3细胞,利用RT-PCR和Western blotting分别检测了miRNA let-7a-1过表达对靶基因IGF-1R和Bcl2 mRNA及蛋白质表达的影响。(4)构建了IGF-1R-3’UTR荧光素酶报告基因质粒,将荧光素酶报道基因质粒与pSilencer-let-7a-1真核表达载体共转染PC-3细胞,荧光素酶报告基因系统检测miRNA let-7a-1与靶基因3’UTR结合位点的作用。(5)IGF-1处理PC-3细胞后,MTT比色法进一步验证miRNA let-7a-1过表达下调IGF-1R,阻断IGF-1R信号通路,抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖。(6)构建了ELK-1荧光素酶报告基因质粒(pGL4-ELK-1),与pSilencer-let-7a-1真核表达载体共转染PC-3细胞,IGF-1处理后,荧光素酶报告基因系统检测miRNA let-7a-1过表达对IGF-1R细胞增殖信号通路的影响,RT-PCR和Western blotting分别检测了miRNAlet-7a-1过表达对IGF-1R信号通路靶基因c-fos表达的影响。(7)RT-PCR检测miRNAlet-7a-1过表达对增殖凋亡相关基因表达的影响。结果:(1)成功构建了miRNA let-7a-1真核表达载体pSilencer-let-7a-1,瞬时转染PC-3细胞后能有效表达。MTT比色法和流式细胞术证实了miRNA let-7a-1能抑制前列腺癌PC-3细胞增殖,促进其凋亡。(2)成功构建了pMIR-Report-let-7a-1T报告基因融合质粒,经DNA测序正确。(3)RT-PCR和Western blotting结果表明,miRNAlet-7a-1过表达有效抑制靶基因IGF-1R mRNA及蛋白质的表达。(4)成功构建了IGF-1R-3’UTR荧光素酶报告基因质粒,与pSilencer-let-7a-1真核表达载体共转染PC-3细胞,荧光素酶报告基因活性明显降低,表明miRNA let-7a-1过表达可直接作用于IGF-1R-3’UTR的靶序列,下调靶基因IGF-1R的表达。(5)IGF-1处理PC-3细胞后,MTT比色法结果显示miRNA let-7a-1能有效抑制IGF-1对前列腺癌PC-3细胞增殖的刺激作用;ELK-1荧光素酶报告基因检测结果显示,miRNA let-7a-1可抑制IGF-1R细胞增殖信号通路;RT-PCR和Western blotting结果显示,miRNAlet-7a-1可使IGF-1R信号通路靶基因c-fos mRNA及蛋白质表达水平下降。(6)RT-PCR结果显示,miRNA let-7a-1下调Cyclin-E、Cyclin-D、CDK6的mRNA的表达,上调P27mRNA的表达。结论:本研究结果表明,miRNA let-7a-1可直接作用于靶基因IGF-1R的3’UTR靶序列,下调IGF-1R的表达,从而抑制IGF-1R信号通路对前列腺癌细胞的促增殖抗凋亡作用。另外,miRNA let-7a-1还可间接作用于细胞周期调节因子Cyclin-E、Cyclin-D.CDK6和P27的表达,影响前列腺癌细胞的增殖。这一研究结果为深入研究miRNA let-7a-1在前列腺癌中的作用奠定了基础。