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自然界中具有良好生物活性的天然产物主要包括聚酮类化合物、非核糖体肽类化合物及二者的杂合体等一系列次级代谢产物。它们的生物合成不仅具有严谨的、普适性的生物合成逻辑,同时也往往蕴含着一些功能新颖的酶。本论文分别就maremycins及稀疏霉素生物合成途径中的新颖酶促反应进行了深入研究。Maremycins是由Streptomyces sp.B9173产生的一组哌嗪二酮吲哚类生物碱,具有一定抗肿瘤活性。前期研究表明,cupin蛋白MarH在maremycin生物合成途径中表现出异构化酶活性,催化（R）-β-甲基吲哚丙酮酸甲基构型的翻转形成（S）-β-甲基吲哚丙酮酸,并进一步产生maremycin的生物合成中间体（2S,3S）-β-甲基色氨酸。在对MarH生物活性进行研究的过程中,我们意外发现,与对照菌株相比,MarH异源表达菌株可以更快地乙酰化培养基中添加的氯霉素。进一步的体外生化实验表明,纯化后的MarH能够以乙酰辅酶A为酰基供体,区域专一性地催化氯霉素C3位羟基发生乙酰化反应,C3位乙酰基移位至C1位羟基后,MarH再次催化暴露的C3位羟基发生乙酰化,生成两次乙酰化氯霉素1,3-二乙酰氯霉素。这表明,MarH除了在maremycin生物合成途径中具有异构化酶活性外,它还表现出氯霉素乙酰转移酶活性。此外,MarH同源蛋白（StnK3,ACPL6197和Cwoe4835）同样被证实具有酰基转移酶活性,且动力学研究证实它们与传统氯霉素酰基转移酶催化活性相似。而且体内实验证实,marH可以作为氯霉素的抗性基因存在。同源序列比对及点突变实验显示,MarH的酰基转移反应机理可能与传统酰基转移酶相似,His64（位于cupin蛋白特征motif 1）对MarH酰基转移酶活性起到关键作用。MarH催化酰基转移反应的过程中,His64咪唑环上处于负电状态的氮原子会夺取氯霉素C3位羟基的质子,使羟基氧处于负电状态,从而对乙酰辅酶A羰基碳发动亲核进攻,完成乙酰基团向羟基的转移。通过检测多种酰基受体及酰基供体,我们发现MarH对酰基受体具有严格选择性,且仅识别R构型底物,但对酰基供体却表现出一定宽泛性。MarH不仅能够催化羟基的乙酰化,还可以催化氨基发生乙酰化,且氨基乙酰化优先于羟基乙酰化发生。MarH及其同源蛋白仅由约130个氨基酸残基构成,却可以同时催化两种截然不同的反应（异构化反应和酰基转移反应）,这在自然界中是非常新颖的,也大大拓展了我们对酶催化机制的认知。稀疏霉素是一种由Streptomyces sparsogenes NRRL2940产生的具有广谱抗菌活性及较好抗肿瘤活性的次级代谢产物。稀疏霉素由6-甲基-尿嘧啶丙烯酸（6-methyl-uracil acrylic acid,UAA）和氧-甲基硫醚甲基-半胱胺醇（oxo-methylthiomethyl-cysteinol,O-MTM-cysteinol）通过酰胺键连接组成。早期同位素喂养实验表明,UAA来源于色氨酸,O-MTM-cysteinol来源于半胱氨酸和甲硫氨酸。根据NRPS生物合成逻辑分析,稀疏霉素生物合成基因簇中应当编码了两个NRPS模块。我们首先通过克隆抗性基因的方法成功克隆到了稀疏霉素的生物合成基因簇。生物信息学分析发现,稀疏霉素基因簇中含有三个NRPS模块,而并非推测的两个。而单基因敲除实验表明这三个NRPS模块均为稀疏霉素生物合成所必需。为验证三个NRPS模块在稀疏霉素生物合成中的作用,我们测定了三个A domain的活性。我们首先异源表达了三个A-PCP didomain,并分别测定了三个A domain催化不同底物发生腺苷化的活性。实验表明,A1 domain和A3domain分别负责了UAA和MTM-L-Cys的活化与加载,而A2 domain对检测底物均没有显示出活性。通过与张文君教授课题组合作,我们进一步证实,MTM-L-Cys被A3 domain活化并加载于PCP3后,会在II型硫酯酶SpsC的协助下转移到PCP2,并在C/E domain的催化下完成构型翻转,最后与加载在PCP1上的UAA缩合形成稀疏霉素骨架结构。稀疏霉素骨架的生物合成研究为系统阐述稀疏霉素生物合成机制及生物工程改造提供了良好的理论基础。而根据A1 domain的底物宽泛性,我们也对非天然前体引导的稀疏霉素结构改造进行了一系列的探索性研究,为新型安全抗肿瘤药物的开发奠定了一定基础。