论文部分内容阅读
目的应用分子生物学、免疫学等多种方法,对新生期树鼩接种人乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)后体内HBV感染标志进行长期动态观察。方法第一部分:优化巢氏聚合酶链反应(nested polymerase chain reaction, nPCR),主要内容有:①血清模板制备:分别用直接煮沸法、碱裂解法抽提血清HBV DNA,比较各抽提方法的目的基因得率、灵敏度及重复性。②引物设计:HBV基因S区,C区保守区段中分别设计两套nPCR引物,对引物的扩增效率进行比较。第二部分:nPCR联合其它方法检测6只新生期接种HBV的树鼩血清和肝组织标本,主要内容有:①应用nPCR和荧光定量聚合酶连反应(fluorescence quantitative PCR, FQ-PCR)检测树鼩血清和肝组织中HBV DNA水平。②应用nPCR和Southern blot检测树鼩肝组织的HBV cccDNA。③应用ELISA和免疫组织化学方法观察树鼩血清和肝组织中HBV标志物。④用电子显微镜寻找肝组织内的HBV颗粒。⑤用光学显微镜观察肝组织病理变化。结果第一部分:①在两种抽提方法中,碱裂解法在目的基因得率、灵敏度、重复性等方面均优于直接煮沸法。②在HBV基因组的C区、S区各筛选出一套引物。第二部分:①用HBV C区、S区引物进行nPCR检测血清标本,结果为1、2和6号三只动物接种后第20周稳定地显示阳性条带至48周,其余3只动物始终阴性;用以上引物检测肝组织标本,6只动物接种后第12周至48周持续显示阳性。DNA测序结果显示以上血清及肝组织中扩增出的HBV DNA C区和S区片段与人HBV相应片段的同源性分别为96.0%和98.0%。②FQ-PCR检测血清结果显示1、2号和6号树鼩在接种后第20～48周内HBV DNA拷贝数为103～104/ml,其余3只动物的血清HBV DNA始终为阴性;FQ-PCR检测肝组织结果显示,1、2和6号动物在接种后第24周～48周HBV DNA拷贝数为107～108/μg肝组织总DNA,其余3只动物一直维持在103～104/μg肝组织总DNA水平。③nPCR检测1、2和6号树鼩肝组织中的HBV cccDNA结果显示阳性;扩增产物进行测序和同源性比较,显示与人HBV相应片段序列的同源性为100%。④Southern blot检测1、2和6号树鼩肝组织中的HBV DNA,结果显示HBV复制中间体HBV cccDNA和HBV ssDNA,并且这些HBV复制中间体在接种后第12、24和36周有逐渐增加的趋势。⑤ELISA检测结果显示1、2和6号树鼩接种后第12、24、36和48周的4次血清标本均呈HBsAg阳性;其余3只动物中,1只在24周前出现HBsAg阳性,以后转为阴性,另两只动物的HBsAg检测始终为阴性。免疫组化检测结果显示1、2和6号树鼩肝组织中可检测到HBsAg,并且HBsAg阳性肝细胞的数量随着观察时间的延长有逐渐增多的趋势;另外3只动物多次肝活检组织的HBsAg标志始终为阴性。⑥电镜下1号动物的肝细胞胞浆内可见直径接近40nm的致密球形颗粒,疑似HBV颗粒。光镜下各动物的肝组织病理改变较轻。结论①经碱裂解法处理的树鼩血清样品用于nPCR效果较好;在HBV C区和S区各选出的一套nPCR引物适用于检测树鼩肝组织和血清标本中的HBV DNA。②新生期接种HBV的树鼩能够长期感染HBV,并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在。