研究背景和目的经济发展伴随着生活水平的的提高,随之而来的是饮食结构的改变。从全世界范围来看,结直肠癌已经发展成为最常见的消化系统肿瘤之一。近年来,随着医疗和科技水平的进步,结直肠癌的诊断与治疗已经取得长足进步。尽管如此,结直肠癌的发病率及死亡率仍处于高发水平,而结直肠癌的转移和预后差是导致死亡的主要原因。因而,研究结直肠癌的发生与转移的机制,对于患者的早期诊断,靶向治疗及生存预后都具有重要意义。泛素化修饰在维持细胞内稳态起到重要作用。泛素化是指泛素(一类低分子量的蛋白质)分子在一系列特殊的酶作用下,将细胞内的蛋白质分类,从中选出靶蛋白分子,并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。这些特殊的酶包括泛素激活酶,结合酶、连结酶和降解酶等。结合酶(E2)家族是泛素蛋白酶复合体系统中的关键部件。Ube2v1(泛素结合酶E2变体蛋白)是E2家族中的一个成员,泛素结合酶结构相似,Ube2v1缺乏保守的半胱氨酸,因此Ube2v1缺乏催化活性。目前研究发现Ube2v1通过激活NF-kappa-B通路调控炎症,但是它在结直肠癌中作用还不明确。自噬与肿瘤的发生和发展密切相关,自噬在肿瘤中的作用比较复杂,尤其是在结直肠癌中的研究还鲜有报道。我们研究发现Ube2v1抑制自噬。在结直肠癌细胞中Ube2v1通过与Ubc13的直接作用促进去乙酰化酶Sirt1的泛素化降解,削弱组蛋白H4K16去乙酰化作用,从而抑制自噬通路中LC3,Beclin1,ATG3,ATG5,ATG7,ATG12,ATG10,ATG4a,ATG4b,ATG4c,ATG4d,ATG16L1等基因转录水平的表达。随后,我们基于构建的Ube2v1过表达和低表达的结直肠癌细胞系,通过细胞生物学实验和裸鼠体内实验,发现Ube2v1通过上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)的方式促进结直肠癌的转移。我们提出假说Ube2v1通过抑制自噬通路促进结直肠癌的转移。为了验证该假说,首先我们通过向裸鼠尾静脉注射过表达Ube2v1的结直肠细胞,构建肺转移模型。分为两组,一组正常观察,另一组小鼠腹腔注射雷帕霉素(Rapamycin)或喂食海藻糖(Trehalose),雷帕霉素和海藻糖均是自噬的诱导剂,经过2个月时间我们比较自噬诱导剂喂食前后小鼠肺部转移灶数目,肺重和体重。结果我们发现加入两种自噬诱导剂后小鼠肺部转移灶数目比对照组(仅尾静脉注入Ube2v1过表达的结直肠癌细胞的小鼠)明显减少。这提示我们自噬诱导剂都能够减弱Ube2v1分子对结直肠癌转移的进程。最后,在临床结直肠癌样本中我们发现Ube2v1呈现高表达,这与结直肠癌患者较差的预后密切相关。我们的研究将泛素蛋白酶复合体系统中的Ube2v1与自噬和结直肠癌的转移连接在了一起。在本研究中,我们发现Ube2v1促进结直肠癌的转移并阐明其作用机制。Ube2v1结合Ubc13,通过泛素蛋白酶体途径降解Sirt1,削弱Sirt1的去乙酰化作用,从而在转录水平上抑制自噬相关基因的表达,促进EMT进程。我们的研究为以泛素蛋白酶体系统重要组分为基础设计出针对性和靶细胞特异性的结直肠癌转移干预措施提供线索和依据。研究方法1、免疫印迹(Western blot,WB)、荧光定量PCR(Real Time-PCR,RT-PCR)以及免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)在结直肠癌细胞和组织中检测Ube2v1、自噬相关基因及EMT相关基因的表达;2、免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)检测自噬流及EMT相关蛋白在人结直肠癌细胞中的表达;3、透射电子显微镜观察自噬小泡;4、标记蛋白组学(TMT)在人结直肠癌细胞中筛选Ube2v1影响的蛋白;5、免疫共沉淀(CO-Immunoprecipitation,CO-IP)研究蛋白之间的直接作用;6、细胞生物学实验(划痕,迁移,侵袭);7、裸鼠皮下成瘤模型,裸鼠肺转移模型的构建;研究结果一、在结直肠癌细胞中Ube2v1抑制自噬通路在结直肠癌细胞株SW480、DLD-1中过表达Ube2v1,WB结果显示自噬指标LC3、Beclin1表达量降低,P62表达量升高。无血清刺激增加细胞饥饿诱导自噬,结果显示Ube2v1对LC3、Beclin1反向调控,对P62正向调控仍然存在;另外在SW480细胞株中过表达Ube2v1后,通过透射电子显微镜下观察到的自噬小泡较对照组显著减少(p<0.05),对SW480细胞株饥饿8小时后,我们发现自噬小泡增多,但是过表达Ube2v1组的自噬小泡仍然明显少于对照组(p<0.05)。IF结果显示Ube2v1敲低后自噬小体数目增加,P62表达下降。二、Ube2v1抑制Sirt1增强组蛋白H4K16去乙酰化水平进而在转录水平调控下游自噬通路相关基因的表达。基于Ube2v1稳定过表达的结直肠癌细胞SW480,通过TMT筛选分析出Ube2v1过表达影响的蛋白,其中我们发现Ube2v1能显著抑制组蛋白的表达,因此我们推测Ube2v1参与组蛋白的修饰。通过WB检测,我们发现Ube2v1能够上调乙酰化H4K16的表达;由于Sirt1主要参与调控H4K16去乙酰化作用,于是我们检测Ube2v1是否通过调控Sirt1对H4K16的去乙酰化。结果显示Ube2v1抑制Sirt1的表达,同时H4K16乙酰化水平增强。Ube2v1过表达后同时过表达Sirt1,检测H4K16乙酰化水平,发现H4K16的乙酰化水平回落。以上结果提示Ube2v1通过抑制Sirt1增加了H4K16的乙酰化水平。RT-PCR的结果显示过表达/敲低Ube2v1以及过表达/敲低Sirt1都可在转录水平调控自噬相关基因。此外,我们发现Ube2v1过表达/敲低可在蛋白水平调控Sirt1,但RT-PCR的结果显示Ube2v1不可以在转录水平调控Sirt1。结合Ube2v1这一泛素连接酶的特点,我们推测Ube2v1对Sirt1的调控很可能是通过泛素化途径。三、结直肠癌细胞中Ube2v1通过结合Ubc13促进Sirt1的泛素化降解。在SW480细胞中加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX),WB检测结果显示Ube2v1能够促进Sirt1的降解。CO-IP结果显示Ube2v1不能直接结合Sirt1,但是Ube2v1过表达能够促进Sirt1的泛素化,参考已有报道提出Ube2v1与Ubc13相互作用形成Ube2v1-Ubc13复合物发挥泛素连接酶的功能,我们进一步发现抑制Ube2v1与Ubc13的作用可以减弱Sirt1的泛素化降解。四、Ube2v1通过抑制自噬促进结直肠癌EMT过程。WB结果显示过表达Ube2v1后EMT中重要的上皮细胞重要蛋白E-cadherin、β-catenin表达降低,间质细胞重要蛋白Vimentin,Fibronectin,N-cadherin表达增加,在敲低Ube2v1后,我们进一步证实了以上结果,表明在Ube2v1促进结直肠癌细胞的EMT进程。为了证明Ube2v1对EMT的调控是否通过自噬途径,我们选取了两个在Ube2v1过表达或低表达后转录水平会出现较为显著的变化的自噬相关基因ATG5和ATG7,。在结直肠癌细胞中同时敲低Ube2v1和ATG5/ATG7,我们发现Ube2v1过表达促进EMT的进程会削弱。五、Ube2v1通过抑制自噬途径促进肿瘤的转移。我们通过尾静脉注射结直肠癌细胞,以此构建裸鼠肺转移模型。我们将小鼠分为四组,组一:尾静脉注射空载体结直肠癌细胞的小鼠;组二:尾静脉注射过表达Ube2v1结直肠癌细胞的小鼠;组三:尾静脉注射过表达Ube2v1结直肠癌细胞同时腹腔注射雷帕霉素的小鼠;组四:尾静脉注射过表达Ube2v1结直肠癌细胞同时喂食海藻糖的小鼠。HE染色结果显示:与组一相比,组二转移瘤的体积更大,数量更多(p<0.05);后经过验证敲低Ube2v1后得到一致的结果(p<0.05)。另外在自噬诱导剂---雷帕霉素的作用下,组三转移瘤的体积和数量均减少(p<0.05)。对以上几组小鼠的肺进行对免疫组化染色,我们将组二与组一相比发现过表达Ube2v1后,自噬指标Beclin1表达降低,上皮细胞指标E-cadherin表达降低;在腹腔注射雷帕霉素这一自噬诱导剂后,组三与组二相比EMT相关蛋白的表达有所回升;组四通过喂食另外一种自噬诱导剂一海藻糖,得到与雷帕霉素处理一致的结果。Ube2v1能够在蛋白水平对Sirt1进行泛素化降解,从而调控H4K16的去乙酰化,进而在转录水平调控自噬相关基因,影响EMT。那么Sirt1能够在转录水平直接调控EMT么?我们在结直肠癌细胞中分别过表达和敲低Sirt1,通过RT-PCR检测EMT重要基因的表达情况。结果显示Sirt1不能在转录水平直接调控EMT。六、Ube2v1在结直肠癌中的表达较癌旁高,且和不良预后密切相关。RT-PCR检测对39对成对的人结直肠癌标本中Ube2v1的表达情况,发现在结直肠癌组织中Ube2v1的转录水平普遍高与癌旁;IHC结果显示在86对成对的人结直肠癌标本中Ube2v1在结直肠癌组织中亦普遍呈现高表达,尤其在远端转移的标本中Ube2v1呈现高表达。利用Public Gene Expression Profile(GSE17537)分析发现,高表达Ube2v1的结直肠癌患者预后生存期较差。