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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是继阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）之后的第二大神经退行性疾病,是一种常见且复杂的神经系统退行性疾病,其主要特征是肌僵直、静止性震颤、运动迟缓和姿势反射障碍等运动症状。此外,PD患者在早期还表现出认知功能障碍、精神异常和自主神经功能障碍等一系列非运动症状。PD的主要病理特征是黑质（substantia nigra,SN）多巴胺（dopamine,DA）能神经元选择性缺失,导致纹状体（striatum,Str）神经元末梢释放DA减少,而残存DA能神经元内出现α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）异常聚集,形成路易小体（Lewy bodies,LBs）。PD的发病机制尚不明确,遗传、环境、衰老、炎症、氧化应激、线粒体功能障碍和铁代谢异常等都可能参与到PD的发生发展中。最近的研究表明,SN区DA能神经元上ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channels,KATP通道)的选择性激活可能参与了PD中SN区DA能神经元的损伤。KATP通道是一种内向整流钾离子通道,由四个内向整流钾通道Kir6.x（inwardly rectifying K channels,Kir）亚基（Kir6.1或Kir6.2）和四个ABC（ATP-binding cassette protein,ABC）家族成员磺酰脲受体（sulfonylurea receptor,SUR）组成。SN区DA能神经元主要表达SUR1/Kir6.2、SUR2B/Kir6.2和SUR1/SUR2B/Kir6.2三种类型的KATP通道。PD病人的尸检报告指出,SN区DA能神经元上KATP通道SUR1亚单位的m RNA水平比对照组高了约两倍。本实验室前期研究也证实,在3月龄和6月龄携带人A53T突变型α-syn转基因小鼠（简称A53Tα-syn转基因小鼠）SN区KATP通道SUR1亚单位的m RNA和蛋白的表达水平均显著上调,但Kir6.2和SUR2B的表达却没有改变。KATP通道作为一种调控能量代谢的元件,可通过感知胞内ATP/ADP比率的变化,将细胞内能量代谢和电活动相耦联。有报道指出,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）或鱼藤酮制备的PD动物模型中,通过记录离体脑片SN区DA能神经元观察到,KATP通道对代谢应激状态变化尤为敏感,KATP通道的开放能够导致细胞膜超极化。对于晚期PD病人的研究指出,SN区DA能神经元的簇状放电显著增多,这种放电模式的改变能够加速DA能神经元的变性死亡。而将KATP通道Kir6.2亚单位敲除后,成年小鼠脑内SN区DA能神经元的簇状放电明显减少。那么,在PD的发病过程中,KATP通道SUR1亚单位选择性上调是否会对SN区DA能神经元的放电模式产生影响,敲低SUR1亚单位是否会对DA能神经元起到保护作用,目前尚不清楚。为了探讨PD发病过程中KATP通道SUR1亚单位表达升高对SN区DA能神经元功能的影响,本实验采用A53Tα-syn转基因小鼠和C57BL/6小鼠为主要研究对象,应用在体细胞外电生理技术,首先观察了正常小鼠SN区KATP通道的开放对DA能神经元自发放电活动的影响。然后,在A53Tα-syn转基因小鼠上,观察SN区DA能神经元自发放电活动随月龄的变化。最后,应用脑立体定向注射技术,将携带SUR1干扰序列的慢病毒注射到A53Tα-syn转基因动物和MPTP诱导的PD动物模型的SN区,应用免疫荧光、高效液相色谱分析和western blots等技术,观察敲低SUR1对两种PD动物模型SN区DA能神经元功能的影响。实验结果如下:1.在正常小鼠黑质记录到的16个DA能神经元中,微压力注射100μmol/L KATP通道开放剂二氮嗪,可以使其中的6个神经元自发放电频率由2.39±0.74 Hz降低至0.89±0.74 Hz,加药后较加药前相比,放电频率平均降低了87.9±8.7%,差别具有统计学意义（P<0.05）。此外,我们对注射二氮嗪前后的自发放电间隔（interspike internal,ISI）的变异系数（coefficient of variation,CV）进行分析,结果显示,加药前后CV值未发生显著改变（P>0.05）。其余的10个DA能神经元,注射KATP通道开放剂二氮嗪,可以使其放电频率由2.69±1.97 Hz降低至2.17±1.77 Hz,频率变化程度小于2倍的标准差,视为不反应细胞。2.在正常小鼠黑质记录到的7个DA能神经元中,微压力注射50μmol/L NMDA受体激动剂NMDA后,自发放电频率由1.46±1.45 Hz升高至3.40±1.29 Hz,加药后较加药前相比,放电频率平均升高了65.14±3.34%,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。注射NMDA前后的ISI的CV值发生明显改变,差别具有统计学意义（P<0.05）。而给予KATP通道抑制剂格列苯脲后,再激动NMDA受体,记录到的5个DA能神经元自发放电频率由2.90±1.63 Hz升高至4.30±2.48 Hz,加药后放电频率较加药前相比平均升高了55.3±40.1%,但差别无明显变化（P>0.05）。阻断KATP通道后,再激动NMDA受体前后的ISI的CV值未发生明显改变（P>0.05）。3.通过记录3月龄及6月龄A53Tα-syn转基因小鼠SN区DA能神经元自发放电情况观察到,与同月龄WT小鼠相比,两种月龄的A53Tα-syn转基因小鼠的SN区DA能神经元自发放电频率均显著增加,差别具有统计学意义（P<0.05）。同时,我们在3月龄A53Tα-syn转基因小鼠上,观察到不规则放电增多且有少量簇状放电的发生;6月龄A53Tα-syn转基因小鼠不规则放电增多且有大量簇状放电的发生。4.将携带SUR1干扰序列的慢病毒载体立体定位注射到4月龄WT小鼠和A53Tα-syn转基因小鼠SN区60天后,观察到WT小鼠和A53Tα-syn转基因小鼠SN区SUR1蛋白水平分别减少了40.93%和34.72%,较空载慢病毒对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。注射空载慢病毒组A53Tα-syn转基因小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数量分别降低了29.36%和19.86%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组A53Tα-syn转基因小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数量分别增加了49.11%和23.41%,与注射空载慢病毒组A53Tα-syn转基因小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。5.在MPTP制备的PD小鼠模型中,SN区TH蛋白表达水平降低了33.17%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.01）。SN区SUR1亚单位m RNA及蛋白表达水平分别升高了54.21%和52.76%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）;而SUR2B或Kir6.2亚单位的m RNA及蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）。6.将携带有SUR1干扰序列的慢病毒载体注射到C57BL/6小鼠SN区21天后,再连续腹腔注射MPTP 5天,注射空载慢病毒组MPTP小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数量分别降低了56.27%和48.42%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.001,P<0.01）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组MPTP小鼠SN区TH蛋白表达水平和TH阳性细胞数分别增加了100.87%和62.95%,与注射空载慢病毒组MPTP小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.05）。同时,高效液相检测结果显示,注射空载慢病毒组MPTP小鼠Str内DA、DOPAC和HVA含量分别减少了89.41%、86.65%和73.16%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.001）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组MPTP小鼠Str内DA、DOPAC和HVA含量分别增加了360.00%、190.00%和86.32%,与注射空载慢病毒组MPTP小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.05,P<0.01,P<0.05）。7.将携带有SUR1干扰序列的慢病毒载体注射到C57BL/6小鼠SN区21天后,再连续腹腔注射MPTP 5天,注射空载慢病毒组MPTP小鼠SOD1蛋白表达水平和Bcl-2/Bax蛋白比值分别减少了40.64%和58.47%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义（P<0.001,P<0.01）;而携带SUR1干扰序列的慢病毒注射组MPTP小鼠SN区SOD1蛋白表达水平和Bcl-2/Bax蛋白比值分别增加了38.48%和102.83%,与注射空载慢病毒组MPTP小鼠相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。综上所述,KATP通道能够参与小鼠SN区DA能神经元簇状放电的发生;在PD的发病过程中,伴随SN区KATP通道SUR1亚单位表达上调,DA能神经元放电频率及簇状放电的发生均显著增加。在PD转基因小鼠和MPTP制备的PD小鼠模型上,敲低SUR1后,可以延缓SN区DA能神经元的退变进程。本研究表明,在PD发病过程中,KATP通道SUR1亚单位在SN区的选择性上调是导致DA能神经元退行性改变的原因,为针对SUR1靶点开发抗帕金森病药物提供了重要依据,进而为PD的治疗提供新的理论基础及实验依据。