鳜鱼(Siniperca chuatsi),又名桂花鱼,肉质鲜嫩、味道鲜美,有“淡水石斑”的美称,是广东省甚至全国淡水鱼养殖业中的优质品种,也是出口创汇型养殖品种之一。随着鳜鱼养殖规模的逐年扩大、养殖环境的恶化以及养殖密度的不断提高,鳜鱼疾病繁多,其中1994年起由传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)引发的鳜鱼虹彩病毒病最严重,发病率超过60%,死亡率超过50%,在最严重时发病塘中鳜鱼死亡率达90%以上,该病毒病每年造成广东省鳜鱼经济损失高达数亿元,对鳜鱼养殖产业造成毁灭性的打击。药物防治是水产养殖病害的重要防治手段,然而抗生素、化药等只能对细菌、寄生虫产生作用,对于病毒病几乎没有作用。目前,以化学药物为典型的破坏环境的水产病害防治方法在世界范围内逐渐被禁用并取缔,取而代之的是生态友好且可持续发展型的水产病害防治措施。免疫接种是防治病毒病的最有效手段。因此,研制鳜传染性脾肾坏死病毒细胞灭活疫苗,解决鳜鱼养殖病害瓶颈问题,符合21世纪水产养殖业“环境友好、优质高效”的发展趋势,具有重大的研究意义。本研究针对鳜传染性脾肾坏死病毒病,将实验室已建立的鳜脑组织细胞系(CPB)作为鳜传染性脾肾坏死病毒QY株(ISKNV-QY)体外繁殖的细胞体系,研究CPB最优培养条件,并对比在不同灭活条件下使用不同灭活剂对ISKNV的灭活效果,确定ISKNV细胞灭活疫苗的灭活制备方法,为制备鳜鱼ISKNV灭活疫苗奠定了前期基础。同时有利于后续优化生产工艺,降低生产成本,更易于为广大养殖户接受。研究内容主要包括两部分:1.选取实验室已建立的鳜脑组织细胞系(CPB)为鳜传染性脾肾坏死病毒QY株(ISKNV-QY)体外细胞培养体系,通过对CPB细胞在不同培养条件下(培养基、血清浓度、PH值及温度)的生长状况观察并进行指标测定,筛选和优化该细胞培养的各种条件。并对该细胞系在GMP中试车间进行15 L细胞转瓶的扩大转瓶培养实验,确定在上述培养条件下,CPB细胞的贴壁性能和转瓶生产参数。2.对ISKNV疫苗的灭活工艺进行了研究,釆用甲醛、β-丙内酯(BPL)、二乙烯亚胺(BEI)、高温灭活这四种灭活方法对CPB细胞培养的ISKNV进行灭活,并把感染后引起细胞病变效应(CPE)作为指标,以细胞盲传培养及鱼体试验来评价灭活病毒的安全性及有效性,对比了使用不同灭活剂和灭活方法制备出的病毒疫苗的免疫效果,确定灭活剂的最适灭活条件,进而选择出合适的灭活剂。研究结果和结论如下:1.通过对不同培养条件下CPB细胞的生长状况进行观察并进行指标测定,确定L15为最佳培养液,10%血清含量最适合CPB细胞生长,pH7.0为最佳pH条件,28℃为最优培养温度。在15 L容量的细胞转瓶上,培养温度为28℃,转速为15转/小时,通过转瓶机培养,4 d可长满,且贴壁很牢固,一星期左右不会有脱落。证明该CPB细胞可适用于转瓶中试生产。2.灭活试验结果显示,终浓度为0.1%的BPL对ISKNV灭活时间最短(12 h就可以彻底灭活,接种CPB细胞无CPE出现),不易残留(37℃,2 h彻底水解),腹腔注射健康鳜鱼无出现死亡现象。不同灭活方法制备的疫苗免疫效果结果显示,BEI虽然灭活时间虽然较长,但灭活最彻底,同时也保留了完整的病毒空间结构,因此从相对免疫保护率结果可看出,使用BEI灭活制备的疫苗,在3 d、21 d和48 d的免疫原性均最好。该结果说明了BEI在ISKNV疫苗的制备过程对病毒抗原破坏作用小于甲醛和BPL,是理想的ISKNV疫苗灭活剂。同时,BEI灭活工艺的最后一道工序是加入硫代硫酸钠进行中和,使抗原液中不存在灭活剂的残留,进一步保证了疫苗的安全性。本研究为制备鳜鱼ISKNV灭活疫苗奠定了前期基础。同时有利于后续优化生产工艺,降低生产成本,更易于为广大养殖户接受。