[研究背景与研究目的]阴阳学说是中医学理论的基石和源头,然而迄今为止其科学内涵尚未完全阐述明确。《素问·阴阳应象大论》说：“阴阳者,天地之道也,万物之纲纪,变化之父母,生杀之本始,神明之府也,治病必求于本。”指出阴阳的对立统一运动是万事万物之本源,世界上一切事物发生、发展、变化及消亡的根本原因。王冰注《素问·生气通天论》曰：“阳气根于阴,阴气根于阳,无阴则阳无以生,无阳则阴无以化。”意思是说阴阳不仅有对立的关系,还具有统一的关系,即相互依存、相互资生的关系,这就是阴阳的“互根互用”理论。阴阳互根互用理论是阴阳学说的重要组成部分,在此基础上,明代张景岳提出了著名的“善补阳者必于阴中求阳,则阳得阴助而生化无穷；善补阴者必于阳中求阴,则阴得阳升而化源不竭”——即“阴中求阳,阳中求阳”的治疗方法,同时创制出“阴中求阳”之右归丸治疗肾阳虚证、“阳中求阴”之左归丸治疗肾阴虚证,具有重大理论与临床意义,是阴阳互根互用理论在调理肾中阴阳临床实践上的具体应用,但是目前肾中阴阳互根互用的机制尚未完全阐明。阴阳学说的现代研究中最受关注的是美国生物学家Glodberg于1975首次提出的环磷酸腺苷(cAMP)与环磷酸鸟苷(cGMP)的阴阳假说。随后国际上Cell、 Science、Nat Cell Biol、Nat Rev Rheumatol、Proc Natl Acad Sci USA 以及 Circ Res等一系列著名的科学杂志都陆续刊登了应用阴阳概念探讨概念来探讨免疫与炎症、氧化与抗氧化、蛋白磷酸化信号传导通路、核转录因子(Yin-Yang1、E2F-1、 MeCP2)抑制与激活等细胞内的诸多事件。这些结果在细胞水平上表明了阴阳学说的普适性与科学性。国内外既往研究中关于功能拮抗性的物质与阴阳对立制约的关系的报道较多,但鲜有关于阴阳互根互用方面的现代研究。中医学的基础理论从古至今传为经典,主要在于反复运用有效,可以经得起临床的考验。因此,将中医学理论活学活用,通过临床的实践观察,并结合现代研究方法,从疗效、基因、免疫等多角度、全方位去探讨及阐明中医基础理论的机制,是当今中医研究学者应该走的道路。中医“证”是疾病发生过程中不同阶段病因病机的高度概括,由于同一证有其共同的临床表达和病理机制,那么我们可以推断其肯定有着共同的物质基础。而生命的中心法则认为基因型(DNA或基因)处于最原始和本质的地位,肾所藏之精禀受于父母,是构成胚胎发育的原始物质,与现代医学的遗传物质DNA具有同一性。本课题组在前期的肾阴虚证相关基因、肾阴虚证和肾阳虚证基因表达谱的比较研究中,通过西医的辨病与中医的辨证相结合,从慢性肾炎、糖尿病肾病、狼疮性肾炎以及亚健康状态等的肾虚证入手,提取外周血白细胞RNA和DNA,应用基因芯片、抑制性消减杂交(SSH)、基因多态性分析和基因克隆等技术和方法,系统地开展了肾阴虚证、肾阳虚证的相关基因研究,成功地构建了肾阴虚证的cDNA文库,结果发现不同病种肾阴虚证的消减文库中存在明显差异；肾阴虚证组和正常对照组间存在79条差异表达基因；肾阳虚证组和正常对照组间存在75条差异表达基因；肾阴虚证和肾阳虚证与正常对照比较存在9条共同差异表达基因。研究结果发现,肾阴虚证、肾阳虚证具有各自不同的基因表达调控网络,提示肾中阴阳有不同的物质基础,使其表现为对立制约的关系；然而它们又有共同的基因表达调控网络,提示肾中阴阳有共同的物质基础,使其表现为互根互用的关系。因此,从基因组学方面深入探讨肾虚证的分子机制对于阐明肾虚证的本质有着至关重要的意义,可能是阐明肾中阴阳互根理论的重要突破口之一。综上所述,本研究拟在前期研究工作的基础上,将具有浓郁中医特色的“阴中求阳、阳中求阴”临床拆方治疗及现代指标观察相结合的途径,通过对肾虚证患者服药前后的临床观察,荧光定量PCR监测肾阴虚证与肾阳虚证的共同差异表达基因,免疫功能测试等,开展对肾阴虚证和肾阳虚证的相关研究,以进一步验证阴阳的互根互用理论,利用现代技术,探寻肾虚证的本质,阐述其作用机制,为中医证候研究提供科学依据。[方法](1)系统回顾与总结肾中阴阳互根的中医理论及中西医治疗肾阴虚、肾阳虚证的现状；(2)采用“病证结合”方法,选取慢性肾小球肾炎及糖尿病的肾阴虚证、肾阳虚证患者以及选择性别、年龄等人口学资料相似的健康的正常人共同作为研究对象。按照“阴中求阳、阳中求阴”的治疗方法,对相应的中药复方(左归丸、右归丸)进行拆方研究：将肾阴虚证患者随机分为阳中求阴(即左归丸)治疗组和滋补肾阴(即左归丸之滋肾阴中药复方)治疗组；将肾阳虚证患者随机分为阴中求阳(即右归丸)治疗组、温补肾阳(即右归丸之温肾阳中药复方)治疗组,观察给药前后相应的临床指标变化。(3)通过对左归丸、左归丸中滋肾阴中药、右归丸,右归丸中温肾阳中药及健康对照组服药前后淋巴细胞转化实验,NK细胞活性测定,外周血白细胞、血清抗体、补体及淋巴细胞亚群观察等进行观察,对实验各组进行相关免疫分析。(4)收集不同组治疗前后外周血白细胞总RNA,制备样品,利用荧光定量PCR技术观察肾阴虚证、肾阳虚证与正常人服药前后白细胞的特定基因表达变化,通过统计软件,对左归丸、右归丸治疗作用相关的基因表达的变化进行分析。[结果]1.系统回顾与总结了肾中阴阳互根的中医理论基础；2.临床观察结果：(1)将肾阴虚证患者随机分为阳中求阴(即左归丸)治疗组、滋补肾阴(即左归丸之滋肾阴中药复方)治疗组进行临床观察：①主要临床症状及舌象脉象观察：60例肾阴虚证的主要临床症状依次是：手足心热52例(占86.7%)、腰部酸痛33例(占55%)、腿膝酸软46例(占76.7%)、五心烦热43例(占71.7%)、潮热35例(占58.3%)、盗汗28例(占46.7%)、咽喉干燥23例(占38.3%)、失眠15例(占25%)、耳鸣18例(占60%),另外还有牙齿松动、月经过少等症状,出现频率较少见。舌象情况：60例肾阴虚证中,舌质红46例(76.7%),舌上有裂纹9例(15%),舌质暗红包括舌有瘀点5例(8.3%)。舌苔出现频数最多的是少苔43例(71.7%),其后依次为无苔11例(18.3%),薄黄苔5例(8.3%),苔黄腻1例(1.7%)。脉象情况：60例肾阴虚证中,脉数28例(46.7%),脉细21例(35%),脉弦8例(13.3%),脉缓出现的较少,为3例(5%)。从脉象性质看,肾阴虚证多表现为细脉及数脉。②两组临床疗效比较经秩和检验分析,Z=-1.975,P=0.048<0.05,两组疗效差异具有统计学意义,提示左归丸组疗效优于左归丸之滋肾阴对照组；两组治疗前后症状积分比较组内比较用配对t检验,治疗前两组组间比较用方差分析,两组治疗后积分比较使用协方差分析。结果表明,治疗前两组间比较无统计学差异,治疗后组内比较配对t检验发现两组治疗前后症状积分的差异均有统计学意义(t治疗组=18.139,t对照组=7.732,P<0.01),治疗组与对照组的干预后症状积分比较差异有统计学意义(F=62.413,P<0.01),说明治疗组在改善肾阴虚证症状方面优于对照组。(2)将肾阳虚证患者随机分为阴中求阳(即右归丸)治疗组、温补肾阳(即右归丸之温肾阳中药复方)治疗组进行临床观察：①主要临床症状及舌象脉象观察：60例肾阳虚证的主要临床症状依次是：畏寒55例(占91.7%)、腰部酸痛51例(占85%)、腿膝酸软48例(占80%)、疲倦乏力42例(占70%)、脱发36例(占60%)、下肢水肿22例(占36.7%)、性欲减退21例(占35%)、手足冷17例(占28.3%)、夜尿多16例(占26.7%),另外还有牙齿松动、记忆力减退等症状,出现频率较少见。舌象情况：60例肾阳虚证中,舌质淡红38例(占63.3%),舌质淡12例(占20%),舌淡有齿印7例(占11.7%),舌质暗红包括舌有瘀点3例(占5%)。舌苔出现频数最多的是苔薄白47例(占78.3%),其后依次为苔薄黄6例(占10%),少苔6例(占10%),苔黄腻或黄稍腻1例(占1.7%)。脉象情况：60例肾阳虚证中,脉沉32例(53.3%),脉细22例(36.7%),脉细弱4例(占6.7%),脉缓出现的较少,为2例(占3.3%)。从脉象性质看,肾阳虚证多表现为虚脉：脉沉、脉细、脉细弱、脉缓。②两组临床疗效比较：经秩和检验分析,Z=-2.062,P=0.039<0.05,两组疗效差异具有统计学意义,提示右归丸组疗效优于右归丸之温肾阳对照组,两组治疗前后症状积分比较：组内比较用配对t检验,治疗前两组组间比较用方差分析,治疗后两组间比较用协方差分析。结果表明,治疗前两组间比较无统计学差异,治疗后组内比较配对t检验发现两组治疗前后症状积分的差异均有统计学意义(P<0.01),治疗组与对照组的干预后症状积分比较差异有统计学意义(F=84.257,P<0.01),说明治疗组在改善肾阳虚证症状方面优于对照组。3.免疫功能测试：①淋巴细胞转化实验显示：左归丸三组治疗前后T淋巴细胞转化实验的刺激指数实验显示,治疗前左归丸组及左归丸中滋肾阴治疗组SI均下降,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。治疗后左归丸治疗组与正常组比较差异无统计学意义,而左归丸之滋肾阴组与正常组比较差异仍有统计学意义。说明治疗后,左归丸治疗组淋巴细胞转化刺激指数较治疗前上升明显,接近正常值,疗效明显优越于左归丸之滋肾阴治疗组。右归丸三组治疗前后淋巴细胞转化实验的刺激指数实验显示,治疗前右归丸组及右归丸中温肾阳治疗组SI均下降,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。治疗后右归丸治疗组与正常组比较差异无统计学意义,而右归丸之温肾阳组与正常组比较差异仍有统计学意义。说明治疗后,右归丸治疗组淋巴细胞转化刺激指数较治疗前上升明显,接近正常值,疗效明显优越于右归丸之温肾阳治疗组。②NK细胞活性测定：左归丸三组治疗前后NK细胞活性测定显示,治疗前左归丸组及左归丸中滋肾阴治疗组NK细胞活性%均下降,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。治疗后左归丸治疗组与正常组比较差异无统计学意义,而左归丸之滋肾阴组与正常组比较差异仍有统计学意义。说明治疗后,NK细胞活性%较治疗前上升明显,与正常组相比无统计学差异,疗效明显优越于左归丸之滋肾阴治疗组。右归丸三组治疗前后NK细胞活性测定显示,治疗前右归丸组及右归丸中温肾阳治疗组NK细胞活性均下降,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。治疗后右归丸治疗组与正常组比较差异无统计学意义,而右归丸之温肾阳组与正常组比较差异仍有统计学意义。说明治疗后,NK细胞活性较治疗前上升明显,接近正常值,疗效明显优越于右归丸之温肾阳治疗组。③外周血白细胞、血清抗体、补体及淋巴细胞亚群观察：外周血白细胞比较：左归丸两组治疗前后外周血白细胞比较t检验结果显示,治疗前后两组组内比较外周血白细胞比较差异均有统计学意义(t治疗组=-7.227,t对照组=-4.401,P<0.01),治疗前两组间白细胞比较差异无统计学意义(F=0.229,P>0.05),治疗后两组间白细胞比较差异有统计学意义(F=7.708,P<0.05)。说明左归丸组及左归丸之滋肾阴组有促进外周血白细胞增高作用,并且治疗组优于对照组。右归丸两组治疗前后外周血白细胞比较：t检验结果显示,两组治疗前后组内比较外周血白细胞比较差异均有统计学意义(t治疗组=-11.794,t对照组=-8.094,P<0.01),治疗前两组间白细胞比较差异无统计学意义(F=2.150,P>0.05),治疗后两组间白细胞比较差异有统计学意义(F=48.724,P<0.05)。说明右归丸组及右归丸之温肾阳组有促进外周血白细胞增高作用,并且治疗组优于对照组。血清抗体、补体和淋巴细胞亚群比较：左归丸两组治疗前后血清抗体和补体比：t检验结果显示,两组治疗前后血清抗体IgG、IgA、IgM和补体C3、C4比较差异均无统计学意义(P>0.05)。说明此次试验两组方药对治疗前后血清抗体和补体影响不大。两组治疗前后淋巴细胞亚群检测比较t检验结果显示,两组治疗前后淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8比较差异均无统计学意义(P>0.05)。说明此次试验两组方药对治疗前后淋巴细胞亚群影响不大。右归丸两组治疗前后血清抗体和补体比较：t检验结果显示,两组治疗前后血清抗体IgG、IgA、IgM和补体C3、C4比较差异均无统计学意义(P>0.05)。说明此次试验两组方药对治疗前后血清抗体和补体影响不大。4.荧光定量PCR测基因表达：经治疗后,左归丸组及左归丸之滋肾阴组中6条基因较治疗前均有上调,但仍未达正常表达水平。左归丸组各条基因表达较左归丸之滋肾阴组中均上调更明显,治疗后两组间比较有显著性差异。经治疗后,右归丸组及右归丸之温肾阳组中6条基因较治疗前均有上调,但仍未达正常表达水平。右归丸组各条基因表达较右归丸之温肾阳组中均上调更明显,治疗后两组间比较有显著性差异。[结论]1.左归丸组在临床治疗肾阴虚证方面优于单纯滋肾阴中药复方对照组,提示“阳中求阴”法优于单纯滋阴治疗。右归丸组在治疗肾阳虚证方面优于单纯温肾阳中药复方治疗组,验证了景岳“阴中求阳”法优于单纯温肾阳治疗方法。验证了张景岳“阴中求阳”、“阳中求阴”方法的科学性。2.从免疫学及基因表达角度均验证了左归丸治疗组较单纯的滋肾阴组,右归丸治疗组较单纯温肾阳组,均有明显的优越性。提示肾中阴阳互根理论在免疫水平及基因水平得到验证,为肾中阴阳互根理论的现代进一步研究奠定基础。