目的：　　 前列腺癌是欧美国家最常见的恶性肿瘤之一，在导致男性死亡的癌症中排第三位。截至2009年全世界约有660，000男性被诊断为前列腺癌，并有250，000男性死于此病。因此，它依旧是威胁人类健康的一个主要问题。早在六十多年前，就已经证实雄激素在前列腺癌的发生发展中起重要作用。因此，去除雄激素也称去势治疗成为前列腺癌治疗的主流。这种治疗方式最初是有效的，然而，在去势治疗2-3年后，复发性前列腺癌中的雄激素信号转导通路又恢复了，雄激素受体在雄激素剥夺后也担当着重要的角色。前列腺癌的发病原因迄今仍不清楚，目前认为激素、人种、遗传和饮食习惯等与发病都有比较密切的关系，其中雄激素在前列腺(癌)的生长、转移与分化中起决定性作用，由雄激素依赖性转变为雄激素非依赖性是每个致死性前列腺癌细胞的根本特性。目前没有治疗复发性前列腺癌的有效方案，因此，研究雄激素受体信号通路为分析前列腺癌的发生发展提供更多的依据，并为新的诊断治疗策略提供理论基础。　　 雄激素与雄激素受体结合后发挥转录因子的作用，调控大量下游靶基因的表达，同时又受到雄激素受体关联蛋白等旁路信号的调节。雄激素受体是核受体超家族的配体依赖式转录因子，其信号通路对包括前列腺在内的男性泌尿生殖系统的发育、功能及稳定是必不可少的，并且在前列腺癌的发生发展以及侵袭转移中起到重要作用。在前列腺癌的各个阶段中，雄激素受体都有一定程度的表达，并且在人及动物模型研究中发现，前列腺癌的原发灶及转移灶中雄激素受体的表达水平与疾病的进程相关。然而雄激素受体并不是独立的对雄激素产生应答，而是需要与不同的转录辅因子发生相互作用而发挥其应答作用。无论是雄激素受体自身的改变还是其转录辅因子的改变都能导致AR信号通路的异常。因此，雄激素受体本身及其相关的辅助调节因子影响着前列腺癌的发生发展。尽管对AR的转录辅因子的调节功能做了大量的研究，但它们在前列腺癌中的作用仍有待于进一步探索。　　 p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)，为一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAK在许多组织中广泛表达，作为小G蛋白Rho家族Cdc42和Racl的下游靶蛋白，可以被生长因子及其他胞外信号通过GTP酶依赖的信号通路或非GTP酶依赖的信号通路活化，发挥多种生物学效应。PAK作为一种重要的生物学调节因子，在哺乳动物细胞中具有重要作用，如：细胞运动、细胞生存、细胞周期、血管生成、基因转录调节及癌细胞的侵袭转移。通过对PAK家族成员信号转导机制的研究，有望为癌症治疗提供分子靶标。　　 到目前为止PAK家族共有6个成员：PAK1-PAK6，根据他们的结构特点及相似性，可分为两大类。第一个亚类包括PAK1(PAKα)、PAK2(PAKγ)、PAK3(PAKβ)，它们的催化区中有80％-90%的序列同源性。较晚发现的第二亚类中含有PAK4、PAK5和PAK6，它们也彼此关系密切，但和第一亚系中的PAK1、PAK2和PAK3催化区序列同源性只有40%-50%，两类PAK在结构组成和调节上都有很显著的差异，也预示着它们有着不同的下游效应器。目前对Ⅱ类PAK的研究主要是与肿瘤相关的细胞凋亡、细胞骨架调节、细胞黏附以及非锚定依赖性生长。PAK6作为Ⅱ类PAK的一员，有报道PAK6能与雄激素受体相互作用作为转录抑制子下调其转录激活活性。　　 本研究在体内外证实PAK6能够与雄激素受体AR发生相互作用，首次发现PAK6可定位于内质网；筛选出PAK6在雄激素受体AR上的磷酸化区域及位点。用共聚焦激光显微镜技术，免疫共沉淀和启动子报告基因等细胞生物学技术研究PAK6在调控AR信号转导通路中的功能及其机制，探讨PAK6在前列腺癌发生发展中的作用，为寻找前列腺癌的治疗靶点提供理论依据。　　 方法　　 一、PAK6与AR在体内外的相互作用及磷酸化位点的筛选　　 1、用GST-pull down实验鉴定PAK6与AR在体外的相互作用并确定其作用区域。　　 克隆PAK6和AR基因及其截短突变片段，构建至不同质粒载体中；GST-pulldown实验确定PAK6与AR相互作用区域。　　 2、利用激酶分析实验筛选PAK6对AR的磷酸化位点。　　 3、在工具细胞HEK293中，共焦激光扫描显微镜观察PAK6的亚细胞定位。　　 4、免疫共沉淀实验确定PAK6，AR与内质网标志蛋白在细胞内的相互作用。　　 5、在工具细胞HEK293中，共聚焦激光扫描显微镜观察PAK6蛋白各截短区域在细胞中的定位。　　 二、PAK6对AR下游靶基因的转录调控　　 1、利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6在工具细胞或前列腺癌细胞系中参与AR介导的转录调控。　　 2、在工具细胞HEK293中，利用共聚焦激光扫描显微镜观察PAK6野生型和激酶死型对于AR转位进入细胞核的影响。　　 3、在前列腺癌细胞PC-3中，利用Western Blot检测PAK6对AR下游靶基因PSA及MMP2表达的影响。　　 4、在前列腺癌细胞PC-3中，利用Western Blot检测核浆蛋白分离后PAK6对AR磷酸化水平的影响。　　 5、利用Transwell assay检测PAK6对前列腺癌细胞CWR22Rvl的迁移能力的影响。　　 三、PAK6促进Mdm2诱导AR经蛋白酶体泛素化降解　　 1、在工具细胞HEK293中，利用Western Blot检测PAK6对AR的蛋白合成水平的调控。　　 2、在工具细胞HEK293及前列腺癌细胞PC-3中，利用Western Blot检测PAK6对AR的泛素化蛋白水平的调控。　　 3、在前列腺癌细胞CWR22Rv1中，利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6与Mdm2在前列腺癌中参与AR对靶基因的转录调控。　　 4、在前列腺癌细胞PC-3中，利用Western Blot检测PAK6与Mdm2对AR下游靶基因PSA及MMP2表达的影响。　　 5、在前列腺癌细胞CWR22Rv1中，利用共聚焦激光显微镜观察PAK6与Mdm2的共定位。　　 6、在前列腺癌细胞CWR22Rv1中，免疫共沉淀实验检测PAK6与Mdm2的细胞内相互作用。　　 7、在工具细胞HEK293中，利用免疫共沉淀检测PAK6与Mdm2对AR的泛素化蛋白水平的调控。　　 结果　　 一、PAK6与AR在体内外的相互作用及磷酸化位点的筛选　　 1、GST-pull down实验证实PAK6与AR在体外的相互作用并确定其相互作用区域。　　 2、利用激酶分析实验确定PAK6对AR的磷酸化位点为丝氨酸578位点。　　 3、在工具细胞HEK293中，共焦激光扫描显微镜观察PAK6定位在细胞中的内质网上。　　 4、免疫共沉淀实验确定PAK6，AR与内质网标志蛋白在细胞内的相互作用。　　 5、在工具细胞HEK293中，共焦激光扫描显微镜观察到PAK6蛋白各截短区域在细胞中的定位。　　 二、PAK6对AR下游靶基因的转录调控　　 1、利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6在工具细胞或前列腺癌细胞系中能够下调AR介导的转录调控。　　 2、在工具细胞HEK293中，利用Western Blot证实PAK6对AR下游靶基因PSA及MMP2表达的负性调控。　　 3、在前列腺癌细胞PC-3中，利用共聚焦激光显微镜技术观察到PAK6野生型和激酶死型对于AR进入细胞核的影响。　　 4、在前列腺癌细胞PC-3中，利用核浆蛋白分离及Western Blot试验证实PAK6野生型在细胞质中增加了对AR的磷酸化作用。　　 5、利用Transwell assay检测PAK6能够抑制前列腺癌细胞CWR22Rv1的迁移。　　 三、PAK6促进Mdm2诱导AR经蛋白酶体泛素化降解　　 1、在工具细胞HEK293中，利用Western Blot检测PAK6影响AR的蛋白合成。　　 2、在工具细胞HEK293及前列腺癌细胞PC-3中，利用Western Blot检测PAK6能够诱导AR经蛋白酶体泛素化降解。　　 3、在前列腺癌细胞CWR22Rv1中，利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6与Mdm2在前列腺癌中参与对AR靶基因的负性转录调控。　　 4、在前列腺癌细胞PC-3中，利用Western Blot检测PAK6与Mdm2对AR下游靶蛋白PSA及MMP2进行负性调控。　　 5、在前列腺癌细胞CWR22Rv1中，利用共聚焦激光显微镜观察PAK6与Mdm2的共定位。　　 6、在前列腺癌细胞CWR22Rv1中，免疫共沉淀实验证实PAK6与Mdm2的细胞内相互作用。　　 7、在工具细胞HEK293中，利用免疫共沉淀证实PAK6促进Mdm2诱导AR经蛋白酶体泛素化降解。　　 结论　　 1、PAK6与AR可以在体内外发生相互作用。　　 2、PAK6对AR的磷酸化位点在丝氨酸578位。　　 3、PAK6与AR共同定位于HEK293细胞内质网上。　　 4、PAK6可以激酶依赖性方式延迟AR转位进入细胞核。　　 5、PAK6作为AR的转录抑制因子抑制AR对其反应元件的转录调控。　　 6、PAK6能够抑制下游靶基因PSA和MMP2的蛋白表达。　　 7、PAK6能够抑制前列腺癌细胞的迁移。　　 8、PAK6可以激酶依赖性的方式促进Mdm2诱导AR经蛋白酶体泛素化降解。