断奶造成仔猪肠道功能紊乱,导致腹泻、生长性能下降甚至死亡,严重影响养猪业的健康发展。虽然腹泻的影响因素较多,但多数研究表明肠道炎症和肠道屏障功能损伤是断奶仔猪易发生腹泻的主要内在原因。大量抗生素用于防治断奶仔猪腹泻,引发细菌耐药性、肉产品中药物残留及环境污染等严重问题；同时抗生素滥用会损害机体肠道屏障功能,破坏肠道稳态。抗菌肽是重要的先天免疫分子,因其广谱抗菌活性、破膜杀菌机制以及不易产生耐药性等特点而受到关注。最新研究表明,抗菌肽不仅具有免疫调节作用,还具有肠道上皮屏障保护功能。然而,抗菌肽应用于防治断奶仔猪腹泻的效果及其对断奶仔猪肠道炎症和肠道上皮屏障功能的作用如何还不得而知。因此,在前期获得了抗菌活性高、安全性好的抗菌肽CWA的基础上,本研究开展了抗菌肽CWA对断奶仔猪腹泻的防治效果试验,同时阐明了抗菌肽CWA对肠道炎症和肠道屏障功能的作用；进一步在小鼠上探究了抗菌肽CWA对细菌感染导致的肠道炎症和肠道屏障功能损伤的作用；最后体外细胞试验初步探讨了抗菌肽CWA缓解肠道炎症和保护肠道屏障功能的作用机制。主要研究结果如下：试验一抗菌肽CWA对断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用(1)抗菌肽CWA对断奶应激仔猪肠道炎症的作用选择18头健康的杜长大仔猪,21日龄断奶后分别腹腔注射3次生理盐水(对照组)和抗菌肽CWA(抗菌肽CWA组),后续饲养7天,研究抗菌肽CWA对仔猪断奶应激腹泻及其肠道炎症的作用。结果表明,抗菌肽CWA降低了断奶仔猪腹泻指数(P<0.05),提高了断奶仔猪ADFI (P<0.05)和ADG (P<0.05)。同时,抗菌肽CWA降低了血清IgG、TNF-α、IL-6、IL-22含量(P<0.05),且提高了血清中TGF-β含量(P<0.05)。在肠道形态方面,抗菌肽CWA提高了空肠的绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度比值(P<0.05),提高了回肠的绒毛高度/隐窝深度比值(P<0.05),降低了回肠的隐窝深度(P<0.05)。在肠道炎症方面,抗菌肽CWA降低了肠道中促炎因子的基因表达,其中对空肠的效果最为显著；同时抗菌肽CWA减少了肠道嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润；提示抗菌肽CWA能够缓解断奶仔猪肠道炎症。在肠道炎症信号通路蛋白表达方面,抗菌肽CWA显著降低空肠组织炎症信号通路中关键蛋白NF-κB、IκB-α的磷酸化水平,提示抗菌肽CWA可能通过下调NF-κB信号通路缓解肠道炎症。(2)抗菌肽CWA对腹泻断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用选择108头腹泻的杜长大断奶仔猪,分别腹腔注射4次生理盐水(对照组)、恩诺沙星(抗生素组)、抗菌肽CWA(抗菌肽CWA组),研究抗菌肽CWA对腹泻断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能的作用。结果表明,抗菌肽CWA和抗生素均降低了断奶仔猪的腹泻指数(P<0.05)和腹泻率(P<0.05),均提高了断奶仔猪ADFI (P＜0.05)和ADG (P＜0.05),且两者无显著差异。在肠道形态方面,抗菌肽CWA和抗生素对小肠绒毛形态损伤均有缓解作用,其中对空肠的作用最显著；扫描电镜和透射电镜观察发现,抗菌肽CWA和抗生素改善了空肠微绒毛数量与长度,且抗菌肽CWA的改善作用优于抗生素。在肠道炎症方面,抗菌肽CWA组和抗生素组均降低了空肠中促炎因子IL-6、IL-8、IL-22的含量(P<0.05),对血清也有类似规律；同时,抗菌肽CWA和抗生素均缓解了腹泻断奶仔猪空肠嗜中性粒细胞浸润；进一步,抗菌肽CWA组和抗生素组均降低了空肠组织中炎症相关蛋白NF-κB、IκB-α、AKT的磷酸化水平及上游调控关键蛋白TLR4、MyD88的表达；且抗菌肽CWA缓解肠道炎症的作用与抗生素相当。在肠道上皮屏障功能方面,抗生素组不仅降低了空肠粘液素和防御素的表达,而且降低了空肠中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达(P<0.05)；然而,抗菌肽CWA却提高了空肠中ZO-1和Occludin的表达(P<0.05)；提示抗菌肽CWA可能提高肠道上皮屏障功能而抗生素却损害肠道上皮屏障功能。在肠道微生物菌群及SCFAs含量方面,与对照组相比,抗菌肽CWA组和抗生素组均降低了粪便中大肠杆菌比例(P<0.05),均提高了粪便中乳酸杆菌/大肠杆菌比值(P<0.05)；然而,抗菌肽CWA提高了粪便中乳酸杆菌比例(P<0.05),抗生素却降低了粪便中乳酸杆菌比例(P<0.05)；进一步,抗菌肽CWA提高了粪便中乙酸、丙酸及丁酸的浓度(P<0.05),而抗生素降低了粪便中丁酸的浓度、丁酸/乙酸比值及丁酸/丙酸比值(P<0.05)。试验二 抗菌肽CWA对细菌感染小鼠肠道炎症和肠道屏障功能的作用在发现抗菌肽CWA缓解断奶仔猪肠道炎症和肠道屏障功能损伤的基础上,进一步在小鼠上研究抗菌肽CWA对细菌感染引起的肠道炎症和肠道屏障功能损伤的影响。选择36只断奶小鼠分为对照组、E.coli组、E.coli+Enro组、E.coli+CWA组,EHEC O157:H7感染后分别腹腔注射生理盐水、恩诺沙星(Enro)、抗菌肽CWA。结果表明,抗菌肽CWA和恩诺沙星均提高了染菌小鼠的存活率,缓解了染菌导致的小鼠体重下降。在肠道形态方面,抗菌肽CWA和恩诺沙星均缓解了染菌导致的小鼠空肠绒毛萎缩、隐窝增生和结肠粘膜上皮破损、杯状细胞数量增加。在炎症方面,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的小鼠血清和结肠中TNF-α、IL-6、IL-10含量升高(P<0.05)；同时均缓解了染菌导致的小鼠空肠中IL-6含量的升高(P<0.05)；抗菌肽CWA在缓解炎症方面与恩诺沙星无显著差异。在肠道抗菌蛋白表达方面,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的空肠中REG3y基因表达升高和结肠中Remlβ基因表达升高(P<0.05)。然而,抗菌肽CWA组了小鼠空肠和结肠中TFF3基因表达水平(P<0.05)。同时,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的小鼠空肠中杯状细胞数量减少、粘液层厚度降低和结肠中杯状细胞数量增加。进一步,Western blot和免疫荧光的结果表明,E.coli+Enro组和E.coli+CWA组均缓解了染菌导致的小鼠空肠MUC-2表达的降低和结肠MUC-2表达的升高(P<0.05)。在肠道上皮屏障功能方面,E.coli+CWA组缓解了染菌导致的小鼠空肠中ZO-1和Occludin蛋白表达的下降(P<0.05),而E.coli+Enro组仅缓解了ZO-1蛋白表达的下降(P<0.05),抗菌肽CWA的效果优于抗生素。在肠道微生物菌群及SCFAs浓度方面,不同处理小鼠盲肠内容物中总菌、双歧杆菌、芽孢杆菌的数量无显著差异,E.coli+Enro组和Ecoli+CWA组均缓解了染菌导致的盲肠中乳酸杆菌数量的降低和大肠杆菌数量的升高(P<0.05),同时Ecoli+CWA组缓解了染菌导致的盲肠中乳酸杆菌/大肠杆菌比值的下降(P<0.05)。同时,Ecoli+CWA组和E.coli+Enro组均对染菌导致的SCFAs浓度的降低具有一定程度的缓解作用。以上结果进一步证明了抗菌肽CWA能够缓解肠道炎症和改善肠道屏障功能,与断奶仔猪的试验结果一致。试验三抗菌肽CWA对肠道炎症和肠遒上皮屏障功能的调控机制(1)抗菌肽CWA缓解肠道炎症的作用机制利用LPS诱导的猪巨噬细胞炎症模型发现,恩诺沙星对LPS导致的炎症反应无缓解作用,而抗菌肽CWA可以缓解LPS导致的炎症反应且呈浓度依赖效应。同时,抗菌肽CWA缓解了LPS导致的IL-6、IL-8、IL-22表达升高和NF-κB、IκB-α磷酸化水平升高(P<0.05)。利用siRNA技术沉默猪巨噬细胞TLR4和MyD88后,抗菌肽CWA缓解炎症的作用受到抑制。利用FITC标记的葡聚糖和流式细胞检测技术发现,抗菌肽CWA可以增强巨噬细胞吞噬FITC-葡聚糖的能力,而使用STAT-1抑制剂后,抗菌肽CWA对巨噬细胞吞噬功能的增强作用受到抑制。以上结果表明,抗菌肽CWA缓解肠道炎症可能是通过TLR4-MyD88-NF-KB信号通路调控炎症反应和通过STAT-1途径增强巨噬细胞吞噬功能等机制发挥作用。(2)抗菌肽CWA改善肠道上皮屏障功能的作用机制利用Caco-2细胞刮伤模型发现,抗菌肽CWA提高了刮伤细胞的愈合速度,改善受损肠道上皮细胞的修复功能。利用猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)屏障功能损伤模型发现,抗菌肽CWA缓解了LPS导致的IPEC-J2单层细胞TER值的下降,同时缓解了LPS导致的肠道上皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白表达的下降。单独添加抗菌肽CWA提高了IPEC-J2细胞中ZO-1和Occludin的表达,而添加Rac1抑制剂NSC 23766时,抗菌肽CWA对ZO-1和Occludin的提高作用受到抑制,且抗菌肽CWA对粘附IPEC-J2细胞的减少EHEC O157:H7作用也被抑制。以上结果表明,抗菌肽CWA能够改善受损肠道上皮细胞的修复功能,通过Racl途径调控肠道上皮细胞紧密连接蛋白表达,增强肠道上皮屏障功能。上述研究不仅为抗菌肽应用于防治断奶仔猪腹泻,实现减少抗生素在畜禽养殖中的使用提供了重要的基础数据与指导意义；而且为由肠道炎症和肠道屏障功能损伤引起人类或者动物的多种肠道疾病提供了新的防治策略。