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嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)作为嗜热菌中乙醇产量较高的菌种,它具有高生长温度,较好的耐酸性以及完整的纤维素和半纤维素代谢系统,这些优点使其成为乙醇生产菌改造的热点。转录系统因背景干扰低,反应组分明确,结果清晰准确成为研究菌体转录情况的有力工具。本研究构建Zethanolicus的体外转录系统,并运用该系统对T.Ethanolicus JW200中的未知蛋白Tethll的功能进行研究。
体外转录系统的构建关键是获得RNA聚合酶。这方面的研究主要是通过异源菌表达体外重组RNA聚合酶以及提取天然菌的RNA聚合酶两个方面来进行的。体外重组中,首先分别构建含有α、β、β、ω和σ亚基的表达载体pET-alpha-His、pET-beta-His、pET-beta-His、pET-omega以及pET-sigma-His,在大肠杆菌中异源表达并纯化获取纯的亚基。其中将α、β、β和ω按照2.2:1:1:1的比例进行体外重组RNA聚合酶核心酶,并通过His-tag亲和层析技术获得了纯化的核心酶。天然酶的纯化是利用聚乙醇胺粗沉淀与NaCl抽提、硫铵沉淀、肝素亲和层析以及DEAE阴离子交换层析技术经过4步纯化获得了纯度为95％天然RNA聚合酶核心酶。另外我们根据T.ethanolicus JW200中的adhB基因及其侧翼序列并以pHsh质粒为模体,构建了转录所用的模板质粒pHsh-tmpl。在69℃下,以该质粒为模板分别用重组RNA聚合和天然RNA聚合酶进行转录,使用地高辛染色检测转录产物,重组RNA聚合酶没有检测到酶活而天然RNA聚合酶转录出预计大小的条带。
Tethll作为一个背景完全未知的蛋白,我们采取生物信息学预测蛋白结构,电泳迁移率变动分析和体外转录实验对其结构和功能进行研究。首先根据该蛋白N段氨基酸序列的测序结果,我们将该蛋白的基因克隆到pET-28a(+)中。测序结果表明该蛋白有297 bp,编码98个氨基酸,理论分子量为11 kD。NCBI比对结果显示该蛋白一级结构上具有两个保守区域,一个在8～11个氨基酸之间,另一个位于第43个氨基酸和第83个氨基酸之间,在三级结构上该蛋白具有螺旋-转角-螺旋的DNA结合模体。通过电泳迁移率变动实验验证,Tethll能特异性结合在adhE基因上游第一个启动子与第二个启动子之间的区域,不与adhB基因上游启动子区域结合。当Tethll终浓度为320 nM时,可以将5 nM TRRadhE完全结合。运用本论文中构建的体外转录系统对该蛋白功能进一步研究,结果显示该蛋白扮演阻遏蛋白的角色同时抑制adhE两个启动子的转录。