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背景与目的:肿瘤干细胞样细胞(stem-like cancer cells, SLCCs)被认为是肿瘤复发的根源之一。肿瘤干细胞样细胞凭借其自身更新能力与处于静止期的特性,摆脱药物杀伤作用,继而导致肿瘤在放化疗后复发。同时,O~ 6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6methylguanine DNA methyltranferase,MGMT)是一种能将DNA上加合物移除,并可修复损伤DNA的酶,临床上影响烷化剂化疗效果。本研究选取MGMT低表达或阴性表达的人脑胶质瘤细胞株,通过“悬浮克隆球形成法”纯化为胶质瘤干细胞样细胞,并对纯化后的胶质瘤干细胞样细胞的肿瘤干细胞特性进行鉴定。方法:选用MGMT低表达或阴性表达的人脑胶质瘤细胞株U251、U373、SKMG-4、SF295、SKMG-1、U87、MGR1和MGR2,采用“悬浮克隆球形成法”将胶质瘤细胞株纯化为胶质瘤干细胞样细胞U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G、U87G、MGR1G和MGR2G。体外无血清培养,通过免疫荧光技术检测干细胞分子标志物CD133、Nestin、Sox-2以及谱系分化标志物GFAP和TuJ1;建立裸鼠皮下肿瘤异种移植模型研究胶质瘤干细胞样细胞致瘤性,每2天观察一次。观察肿瘤出现时间,并用游标卡尺量度肿瘤最大直径。结果:经“悬浮克隆球形成法”纯化后的胶质瘤干细胞样细胞U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G、U87G、MGR1G和MGR2G。在干细胞培养液中呈悬浮肿瘤球状生长,能连续传代并保持较好的增殖生长能力。胶质瘤干细胞样细胞高表达CD133、Nestin和Sox-2,并且低表达分化谱系标记GFAP和TUJ1。皮下注射1×10~4个胶质瘤干细胞样细胞和1×10~4个胶质瘤细胞6周后,胶质瘤干细胞样细胞和胶质瘤细胞株所对应的裸鼠均能成瘤。胶质瘤干细胞样细胞瘤体最大直径为1.4±0.7cm,胶质瘤细胞株瘤体最大直径为0.6±0.4cm。胶质瘤干细胞样细胞所致的瘤体最大直径比注射同等量贴壁生长的胶质瘤细胞所致的瘤体最大直径明显大(P<0.05)。结论:经“悬浮克隆球形成法”纯化后的胶质瘤干细胞样细胞有肿瘤干细胞特性。第二章MGMT在胶质瘤干细胞样细胞中的表达研究目的:研究MGMT在胶质瘤干细胞样细胞中的表达状况。方法:(1)对胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞样细胞采用RT-PCR检测MGMT基因表达;(2)应用western blot检测MGMT蛋白在胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞样细胞中的表达;(3)使用甲基化PCR(MSP)检测胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞样细胞中MGMT启动子甲基化状况。应用QauntityOne软件和CORELDRAWX4软件对数据进行分析。结果:(1) RT-PCR检测观察得U251、U373、SKMG-4、SF295、SKMG-1、U87、MGR1和MGR2 8株胶质瘤细胞株中除U373 MGMT基因为弱表达外,其余胶质瘤细胞株为MGMT阴性表达;U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1 G中MGMT基因为阳性表达,而U87G、MGR1G和MGR2G中MGMT基因为阴性表达。(2) Western blot检测得8株胶质瘤细胞株中MGMT蛋白表达均为阴性表达;胶质瘤干细胞样细胞中U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1G中MGMT蛋白为阳性表达,而U87G、MGR1G和MGR2G中MGMT蛋白为阴性表达。(3) MSP检测得8株胶质瘤细胞株MGMT启动子均有甲基化,U373 MGMT启动子弱去甲基化;胶质瘤干细胞样细胞均有MGMT启动子甲基化,而U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1G MGMT启动子同时存在去甲基化,U87G、MGR1G和MGR2G MGMT启动子无去甲基化。结论:部分胶质瘤干细胞样细胞为MGMT阳性表达,MGMT启动子存在去甲基化;但同时也有部分胶质瘤干细胞样细胞仍为MGMT阴性表达,MGMT启动子不存在去甲基化。第三章胶质瘤干细胞样细胞中MGMT表达与体外替莫唑胺耐药的关系目的:探讨胶质瘤干细胞样细胞中MGMT表达与体外对烷化剂药物(temozolomide, TMZ)耐药的关系。方法:通过CCK-8法检测不同浓度TMZ对胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞样细胞的杀伤作用,计算出半数抑制浓度(50 percents inhibiting concentrtion, IC50)。所得数据结果处理采用SPSS 16.0统计分析软件分析,用(x|—)±s表示,P<0.05为有显著性统计学意义。结果:CCK-8法检测得8株胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞样细胞均随TMZ的浓度增加,细胞生存率逐渐下降。所得各个细胞IC50 (TMZ,μmol/l)分别为U251G(1527.23±74.71)、U373G(1270.57±188.67)、SKMG-4G(1570.84±99.69)、SF295G(1502.84±74.57)、SKMG-1G(1384.81±133.13)、U87G(1520.89±277.64)、MGR1G(1361.12±47.81)、MGR2G(1455.99±243.65)、U251(501.06±61.68)、U373(592.36±25.69)、SKMG-4(527.50±64.23)、SF295(608.70±28.15)、SKMG-1(597.21±60.75)、U87(592.42±92.36)、MGR1(431.87±85.18)、MGR2(638.75±144.74)。胶质瘤细胞与胶质瘤干细胞样细胞IC50在统计学上有明显差异(P=0.00<0.05);MGMT阳性表达与MGMT阴性表达胶质瘤干细胞样细胞IC50在统计学上无明显差异(P=0.94>0.05)。结论:胶质瘤干细胞样细胞较胶质瘤细胞株对TMZ更为耐受;MGMT阳性表达与MGMT阴性表达胶质瘤干细胞样细胞对TMZ耐受差异不明显。目的:研究NF-κB与MGMT表达之间的关系;探讨通过靶向NF-κB通路来调控MGMT的表达,从而逆转MGMT阳性表达胶质瘤干细胞样细胞对TMZ耐药的分子机制。方法:(1)应用CCK-8法检测MG-132(蛋白酶体抑制剂,可抑制NF-κB激活)与TMZ对MGMT阳性表达的胶质瘤干细胞样细胞(U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1G)及其相对应纯化前胶质瘤细胞株(U251、U373、SKMG-4、SF295和SKMG-1)的联合杀伤作用。(2) RT-PCR检测不同用药组(空白对照组、TMZ组、MG-132组和TMZ+MG-132组)MGMT阳性表达的胶质瘤干细胞样细胞(U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1G)及其纯化前相对应胶质瘤细胞株(U251、U373、SKMG-4、SF295和SKMG-1)中MGMT和NF-κB基因的表达状况;(3) western blot检测不同用药组(空白对照组、TMZ组、MG-132组和TMZ+MG-132组)MGMT阳性表达的胶质瘤干细胞样细胞(U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1G)及其相对应胶质瘤细胞株(U251、U373、SKMG-4、SF295和SKMG-1)中MGMT和NF-κB蛋白的表达状况。所得数据结果处理采用SPSS 16.0统计分析软件分析,用(x|—)±s表示,P<0.05为有显著性统计学意义。RT-PCR与western blot数据用QauntityOne软件和CORELDRAWX4软件对数据进行分析。结果:(1) CCK-8法检测得经MG-132与TMZ联合作用后,对MGMT表达的胶质瘤干细胞样细胞U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G和SKMG-1G有增强杀伤作用,而相对应的胶质瘤细胞株U251、U373、SKMG-4、SF295和SKMG-1经MG-132与TMZ联合作用后未见协同杀伤效果。各组药物对各个胶质瘤干细胞样细胞杀伤率(%)为:(2) RT-PCR结果显示胶质瘤干细胞样细胞(U251G, U373G, SKMG-4G, SF295G和SKMG-1G)在空白对照组中NF-κB与MGMT基因均为阳性表达; TMZ处理后NF-κB基因无明显下调,而MGMT基因表达下调;MG-132处理后NF-κB基因明显下调,MGMT基因表达也有所下调;MG-132与TMZ联用后NF-κB基因也明显下调;MGMT基因也有所下调。(3) western blot结果显示胶质瘤干细胞样细胞(U251G, U373G, SKMG-4G, SF295G和SKMG-1G)在空白对照组中NF-κB与MGMT蛋白均为阳性表达; TMZ处理后NF-κB蛋白无明显下调,而MGMT蛋白表达下调;MG-132处理后NF-κB蛋白明显下调,MGMT蛋白表达也有所下调;MG-132与TMZ联用后NF-κB蛋白也明显下调;MGMT蛋白也有所下调。相对应胶质瘤细胞U251、U373、SKMG-4、SF295和SKMG-1:(4) RT-PCR结果显示在空白对照组中NF-κB基因均为阳性表达,MGMT基因在U251、SKMG-4、SF295和SKMG-1中MGMT基因均为阴性表达,U373 MGMT基因为弱表达;经TMZ处理后NF-κB基因表达无明显下调,MGMT基因均为阴性表达;MG-132处理后NF-κB基因有明显下调,MGMT基因均为阴性表达;MG-132与TMZ联合作用后NF-κB基因有明显下调,MGMT基因均为阴性表达。(5) western blot在空白对照组中NF-κB蛋白均为阳性表达,MGMT蛋白均为阴性表达;经TMZ处理后NF-κB基因表达无明显下调,MGMT基因均为阴性表达;MG-132处理后NF-κB基因有明显下调,MGMT基因均为阴性表达;MG-132与TMZ联合作用后NF-κB基因有明显下调,MGMT基因均为阴性表达。结论:TMZ与NF-κB抑制剂MG-132联用对MGMT阳性表达的胶质瘤干细胞样细胞有协同杀伤的作用;但对MGMT阴性表达胶质瘤细胞株无明显协同杀伤作用。在未加药物处理情况下,MGMT阳性表达的胶质瘤干细胞样细胞中NF-κB与MGMT同样存在阳性表达,但在胶质瘤细胞株中NF-κB为阳性表达,但MGMT则为阴性表达。TMZ对NF-κB的调控无明显作用,但可以下调MGMT表达;通过下调NF-κB表达可以降低MGMT的表达水平,实现MGMT阳性表达胶质瘤干细胞样细胞对TMZ的耐药逆转,提示NF-κB与MGMT存在着正相关的联系。