急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是临床上常见的急腹症之一，常合并各种并发症，病死率高。引起AP的病因较多，目前，临床和实验研究证明，细胞因子和氧化应激在AP的发生发展中起重要作用。 与AP发生发展有关的细胞因子包括白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)等。细胞因子介导的炎症反应在AP的病理生理变化及引起的多脏器功能受损中发挥重要作用。如果应用细胞因子抑制剂阻断细胞因子介导的级联炎症反应，可以减轻胰腺炎的损伤和全身炎症反应。TNF-α是在AP发病后较早出现的促炎细胞因子，在AP发病后短时间内迅速升高。TNF-α可诱导白细胞介素．6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)产生，并能刺激一氧化氮和氧自由基的生成，可促使白细胞趋化、黏附，还可使血管内皮细胞通透性增加，损伤微循环。 己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)是甲基黄嘌呤的衍生物，具有改善微循环、抑制血小板聚集的作用，已应用于临床多个领域，尤其被广泛用于治疗脑血管疾病。PTX是一种非选择性磷酸二酯酶抑制剂，能阻断环磷酸腺苷(cAMP)转变为AMP，引起细胞内cAMP浓度升高，从而抑制细胞内多种物质mRNA．的表达，如TNF-α、iNOS、IFN-7、IL-10等。应用PTX可阻断细胞因子的级联反应，进一步抑制氧自由基的生成，可以减轻胰腺炎症反应。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是细胞内的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在转导细胞外信号入核的过程中发挥重要作用。MAPK有4个亚家族：细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化的蛋白激酶(p38 MAPK)和巨丝裂原活化蛋白激酶1(BMK1/ERK5)。许多学者已证实，JNK、p38 MAPK在胰腺损伤及炎症反应中发挥重要作用。JNK、p38 MAPK可被脂多糖(LPS)、TNF-α、IL-1等刺激因子激活，活化的JNK、p38 MAPK转移入核，进一步激活核转录因子，从而参与细胞增殖、转化、凋亡等生物学过程。一些文献报道了p38 MAPK和JNK信号转导通路在.AP发生发展中的作用机制，通过抑制p38 MAPK和JNK的激活、减少炎症细胞因子的产生而改善AP的病变程度。 有研究提出胰腺腺泡细胞的凋亡发生率与AP病变的严重程度成负相关，诱导细胞凋亡可减轻AP的严重程度，但过度诱导凋亡会加重胰腺的损害。那么通过诱导或抑制腺泡细胞的凋亡，就可以调控AP的严重程度。 一些研究表明信号转导通路的激活参与了胰腺细胞的凋亡。因此阻断信号转导通路后可抑制炎性因子的表达，使胰腺细胞凋亡发生改变，可能影响AP病程的进展。 目的： 本研究采用3.5％牛磺胆酸钠诱导大鼠AP模型，并给予PTX干预，通过MAPK信号转导通路，观察TNF-α、ICAM-1和胰腺腺泡细胞凋亡的变化，探讨PTX对AP的保护作用及其机制。 方法： 1 实验动物模型的制备：选取清洁健康wistar雄性大鼠(120只)，实验前24小时开始禁食，自由饮水。10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔内注射麻醉，上腹正中切口进入腹腔，显露胰胆管，在近肝门处用无创血管夹夹闭胰胆管后，用4号加工钝头头皮静脉针于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管，以0.2ml/min速度注入3.5％牛磺胆酸钠(0.1ml/100g)，推药后用无创血管夹夹住胆胰管入十二指肠处，观察10min，去除血管夹，关腹。 2 实验动物分组 1、)假手术组(SO组)：开腹翻动十二指肠并触摸胰腺3次(n=30)。 2)急性胰腺炎组(AP组)：3.5％牛磺胆酸钠诱导的AP模型(n=30)。 3)生理盐水对照组(AP-NS组)：制造急性胰腺炎模型成功后，腹腔内注射同等剂量的生理盐水(n=30)。 4)急性胰腺炎组+己酮可可碱(pentoxifylline，PTX)组(AP-PTX组)：制造急性胰腺炎模型成功后，腹腔内注射PTX(50mg/kg)(n=30)。 另选取6只大鼠作为正常组，处死后留取胰腺组织用于检测p-p38 MAPK和p-JNKl的表达。 3 标本采集：按1h，3h，6h，9h，12h时间点，分别处死大鼠留取血液和胰腺组织，每时间点6只大鼠。 4 测定指标及方法 1)血淀粉酶测定：采用生化自动分析仪测定。 2)胰腺炎组织病理学：HE染色，光镜下观察胰腺组织病理变化。 3)血清细胞因子测定：采用ELISA方法测定血清TNF-α、ICAM-1的表达。 4)p38 MAPK及JNK1活性的测定：采用Western blotting方法测定，分别检测p-JNKl、p-p38 MAPK的表达。 5)胰腺细胞凋亡的检测：TUNEL方法检测胰腺细胞的凋亡率。 结果 1 血清淀粉酶水平SO组血清淀粉酶水平在各时间点无显著性变化，均低于其他组(P<0.01)，AP组、AP-NS组及AP-PTX组血清淀粉酶水平随时间的延长而逐渐增高。其中AP-PTX组各时间点血清淀粉酶水平均显著低于AP组和.AP-NS组(P<0.01)。 2 胰腺组织病理学结果SO组各时间点胰腺轻度水肿，光镜下，除了局限间质水肿，胰腺组织结构清晰，腺泡小叶完整、无坏死、间质水肿和炎症细胞浸润。AP-NS组可见血性腹水，胰腺有坏死灶，光镜下可见胰腺间质水肿，小叶间隙增大，残余腺泡肿胀；并可见弥漫性出血坏死和腺泡小叶结构破坏，周围有大量的嗜中性粒细胞及单核细胞等炎症细胞浸润。AP-PTX组腹水减少，光镜下胰腺组织水肿、出血不明显，腺泡细胞变性和腺泡小叶结构破坏程度较轻，炎症细胞浸润减少。 3 血清TNF-α、ICAM-1含量在SO组，血清TNF-α和ICAM-1水平在各时间点无显著性变化，均低于其他组(P<0.01)；在AP组、AP-NS组及AP-PTX组，血清TNF-α水平在造模后逐渐升高并在6h达到高峰，各组峰值分别为(174.84±7.87)ng/ml、(179.56±6.79)ng/ml和(163.46±7.51)ng/ml。AP组、AP-NS组及AP-PTX组血清ICAM-1水平随时间的延长而逐渐升高。AP-PTX组各时间点TNF-α水平均显著低于AP组和AP-NS组(P<0.05)，除1h外AP-PTX组其他时间点ICAM-1水平显著低于AP组和AP-NS组(P<0.05)。 4 p-p38 MAPK和P-JNK1的表达 4.1 p-p38 MAPK的表达Western blotting显示，在38kD的位置出现一条杂交带，43kD的位置出现内参照β-actin的特异条带。经光密度测定分析结果：AP组1h P-p38 MAPK的积分光密度值(IOD)显著升高，3h达到峰值(0.9975±0.005)。与SO组的IOD值(0.8933±0.03215)相比，AP组的IOD值升高(0.9803±0.02001，P<0.0 1)。与AP-NS组IOD值(0.9953±0.0808)相比，AP-PTX组P-p38MAPK的IOD值明显降低(0.8883±0.01767，P<0.01)。 4.2 P-JNK1的表达Western blotting显示，在46kD的位置出现一条杂交带，43kD的位置出现内参照β-actin的特异条带。光密度测定分析结果：AP组1h P-JNK1的IOD值显著升高至峰值(0.9343±0.03151)。与SO组IOD值(0.6467±0.01528)相比，AP组P-JNK1的IOD值升高(0.9100±0.06083，P<0.01)。与AP-NS组IOD值(0.9367±0.02082)相比，AP-PTX组P-JNK1的IOD值降低(0.6267±0.02309，P<0.01)。 5 胰腺腺泡细胞凋亡在SO组，可见极少量胰腺腺泡细胞凋亡。AP组造模后1h、3h、6h可见胰腺腺泡细胞凋亡，造模后9h、12h可见胰腺腺泡细胞坏死，少量胰腺腺泡细胞凋亡。与AP组、AP-NS组各时间点相比，AP-PTX组胰腺腺泡细胞凋亡增多，凋亡指数增加(P<0.05)。 结论： 1 在牛磺胆酸钠诱导的AP大鼠中，血清淀粉酶升高，胰腺组织出现水肿、炎性浸润、腺泡出血坏死等病理学改变。给予PTX治疗后血清淀粉酶降低，胰腺病理学改变明显减轻。 2 在AP大鼠，血清TNF-α水平随时间的延长逐渐升高并在6h达到高峰；ICAM一1水平也随时间的延长而逐渐升高。在AP-PTX组，TNF-α和ICAM-1水平均显著低于AP组和AP-NS组，提示PTX可明显抑制这两种炎性因子的释放。 3 AP大鼠胰腺组织p-p38 MAPK、p-JNK1表达明显升高，表明MAPK信号转导通路在AP的发生发展中发挥作用。PTX可抑制胰腺组织p-p38 MAPK、p-JNK1的表达。 4 在AP早期即见有较多的胰腺腺泡细胞凋亡，PTX能够诱导细胞凋亡，诱导细胞凋亡可以减轻AP的病变程度。 5 本研究表明，PTX在AP损伤中有保护作用，这种保护作用可能与抑制MAPK通路(p38 MAPK和JNK1)有关，由于MARK通路的抑制，减少炎性细胞因子(TNF-α和ICAM-1)的产生，诱导细胞凋亡。