L-天冬氨酸-α-脱羧酶的分子改造

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化工品的生物法生产是解决能源危机和环境污染问题的重要途径。β-丙氨酸是一种重要的化工中间体,主要用于生产泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、巴柳氮等医药化工品。目前β-丙氨酸主要依赖化学合成,存在能耗大、三废处理要求较高等问题,工业界期待建立一条清洁、高效的β-丙氨酸生物合成路线。广泛参与细菌体内泛酸代谢的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(ADC)能特异地催化L-天冬氨酸脱去α-羧基生成β-丙氨酸。由于底物L-天冬氨酸来源广泛、价格低廉,利用ADC催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸已经在工业规模上实现。然而,ADC的活性和稳定性对β-丙氨酸的生产效率和成本有重要影响。本论文旨在提高ADC的活性和稳定性,以期进一步提高L-天冬氨酸生物转化为β-丙氨酸的效率。  本文对来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的三种ADC的常规酶学性质进行了系统比较,发现来源于枯草芽胞杆菌的ADC具有更好的活性、热稳定性及转化效率,更具有工业应用潜力。分析了ADC在催化过程中“不催化不失活,催化越快失活越快”的机理性失活现象,提出通过提高ADC正确催化的效率来减少机理性失活、从而提高β-丙氨酸转化效率的策略。进而以二乙酰基苯和β-巯基乙醇对β-丙氨酸的选择性荧光反应为原理,设计并构建了一个针对ADC活性的高通量筛选体系。对来源于枯草芽胞杆菌的ADC构建突变文库,筛选获得分别在17位、88位及127位氨基酸发生突变的突变体,其活性相对野生型分别提高27%、18%及18%,后两个突变体的工作稳定性分别提高64%和20%。第88位氨基酸突变对ADC转化效率影响最大,突变体D5的β-丙氨酸产率达到0.071 g L-1 h-1mg-1,比野生型提高了50%。
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