枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性杆菌，为非致病菌，在营养缺乏时可形成芽孢，目前作为益生菌广泛用于人和动物。成熟的枯草杆菌芽孢处于代谢静止状态，具有独特抗性，能在高温、干燥、有害化学毒物等极端状态下存活。这些特性使得芽孢可作为传递外源抗原至肠胃等极端环境的理想载体，因而被用于疫苗载体的研制。芽孢疫苗的独特抗性使其更适合在发展中国家或某些不便于冷藏疫苗的紧急情况下使用。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不稳定等因素影响，使其应用受到一定限制。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，为其作为疫苗载体的研究奠定了稳固的基础，并展现出良好的应用前景。　　 本文以日本血吸虫26kDa GST(Sj26GST)蛋白为模式抗原，利用枯草杆菌表达质粒pUS186将Sj26GST基因构建于枯草杆菌芽孢衣壳基因CotC启动子及其编码序列的下游，在WB600胞外酶缺陷菌株中实现了外源蛋白Sj26GST在芽孢衣壳表面高表达。利用穿梭整合质粒pDG1664、pDG364，将Sj26GST通过双交叉置换整合于枯草杆菌染色体，与CotC或CotB融合表达于芽孢衣壳外表面；同时利用枯草杆菌rrnO启动子实现了Sj26GST在繁殖体细胞内表达。免疫学水平实验证明，Sj26GST疫苗候选株口服、滴鼻免疫小鼠能引起系统和黏膜免疫反应，以Th2为主导的Th1/Th2混合型免疫反应。　　 此外，本文利用枯草芽孢杆菌内生芽孢构建了多价抗原融合表达体系，选用破伤风毒素C片段(TTFC)作为免疫佐剂分子，与Sj26GST基因融合后以三种形式构建表达体系：在芽孢外表面展示(与芽孢CotB或CotC外壳蛋白融合表达)；在芽孢萌发为繁殖体中的表达；以及芽孢与繁殖体双转构建相结合的方式表达。荧光免疫学实验、激光共聚焦显微镜检测到外源蛋白在芽孢外表面成功地表达，同时也证明了多价重组抗原的大分子结构不影响芽孢外层蛋白的组装和芽孢形成。　　 本文还评估了芽孢的免疫佐剂效应。我们利用分子信息学进行分析并用实验方法检测了芽孢杆菌不同种属的物理化学特性，选择枯草芽孢杆菌PY79，HU58和克劳氏芽孢杆菌O/C作为非重组芽孢-蛋白疫苗的载体与蛋白混合，证实了芽孢对蛋白的吸附作用，用吸附蛋白的芽孢滴鼻免疫小鼠能引起强烈的黏膜免疫反应，在肺组织、粪便、唾液中均能检测到高水平的Sj26GST特异性sIgA的分泌。同时，也能激发小鼠系统免疫反应，IgG亚类提示为以Thl占主导的Th1/Th2混合型免疫反应。利用此免疫反应诱导的均衡Th1和Th2反应，有利于提升日本。血吸虫免疫保护作用。证实了芽孢作为新型黏膜疫苗佐剂，能提高机体特异性和非特异性免疫水平，能调节免疫反应类型。非重组芽孢-蛋白疫苗免疫效果较重组芽孢更佳，但由于其吸附的抗原蛋白不能通过胃屏障，只能以滴鼻形式免疫而使其应用受到一定限制。　　 本文通过构建多种芽孢疫苗技术平台，实现了外源蛋白在重组枯草杆菌的芽孢衣壳展示和繁殖体的双功能表达，并使用不同的黏膜免疫方式进行了免疫学评价。研究表明，最有效的重组芽孢疫苗接种策略是芽孢表面与营养繁殖体细胞中的双转表达，使用三次剂量足以刺激小鼠产生Sj26GST特异性免疫反应。此外，对于非重组芽孢-蛋白疫苗，滴鼻免疫是最佳接种方式，小剂量的接种能引起强烈地特异性地系统、黏膜免疫反应和细胞免疫反应。本文构建的多种形式的益生菌芽孢黏膜疫苗平台和免疫学评价体系，为芽孢杆菌表达系统提供了应用指导，为研发高效的第二代抗日本血吸虫疫苗提供了理论基础，并为研发其他感染性疾病的创新型益生菌芽孢黏膜疫苗提供了新思路和技术平台。