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甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物,更是中国最重要的油料作物,其产油量约占中国食用植物油总量的55%左右。油菜叶片形态突变（如表皮蜡质缺失）及颜色突变（如叶片黄化、花斑状等）易于观察,是叶片突变体的重要类型。蜡质作为植物表皮角质层的重要组成部分,在植物抵抗外界环境胁迫中起重要作用。植物叶色的变化会对植物的光合作用以及生长发育产生重要影响。在甘蓝型油菜中,对上述两种性状的研究目前还处于初级阶段,有待深入挖掘新的功能基因和新的作用机制。本课题分别主要利用正向遗传学和反向遗传学手段,对一个甘蓝型油菜表皮蜡质缺失显性突变体以及一个功能未知基因YELLOW COTYLEDON（Bn.YCO）进行研究。第一部分,通过正向遗传学手段,主要以油菜测序品种Damor和中双11（ZS11）基因组序列为参考设计引物,在有蜡粉和无蜡粉材料中进行多态性检测,将候选基因BnaA.GL定位到甘蓝型油菜A09染色体末端约462Kb区段内。随后利用small RNA测序等技术鉴定出可能与蜡质合成相关的miRNAs。第二部分,从反向遗传学角度入手,利用CRISPR/Cas9技术在油菜中同时敲除功能未知基因Bn.YCO的两个拷贝,创造其功能缺失的叶片失绿突变体,发现其可能是通过调控叶绿体基因的转录,从而影响叶绿体的发育和叶绿素的合成。主要研究结果如下。1.蜡质缺失突变体表型分析。肉眼观察发现,蜡质缺失突变体叶片和茎秆呈现亮绿色;冷冻扫描电镜结果显示,其茎秆和叶片表面光滑,几乎没有蜡质晶体覆盖。气相色谱法-质谱法联用分析蜡质组分后发现,在突变体叶片中,几乎检测不到烷烃,同时C29次级醇和C29酮的含量显著减少;相反C30醛的含量显著增加。2.BnaA.GL基因精细定位。以甘蓝型油菜测序品种Damor和ZS11基因组为参考基因组,设计SSR和IP标记,对显性突变位点进行精细定位,成功开发5个与目标基因BnaA.GL共分离标记,分别为 IP-12、UNN-SSR-2、D17-SSR-2、D17-SSR-13和Bol-SSR-4。共分离标记距离A09染色体末端462,254kb。对该候选区段所包含的95个基因进行功能注释,结果显示其中包含1个延长复合体编码基因KCS、2个乙烯类型转录因子（AP2/ERF）以及2个烷烃合成基因（CER1,CER1-LIKE）。3.蜡质缺失突变体茎秆和有蜡粉茎秆表皮转录组分析。有3个与蜡质合成相关的基因在两种材料中差异表达,分别为初级醇合成基因BnaC01g04460D（CER4）和BnaC08g27570D（FAR6）,以及烷烃合成基因BnaCnng0900D（CER1）。推测可能由于上述基因表达量的变化,导致蜡质含量降低。4.差异表达miRNAs分析。取播种后4周的蜡质缺失突变体茎秆和有蜡粉茎秆表皮为材料,进行small RNA测序分析。在4个文库中,共鉴定到300个保守的miRNAs,预测到 553 个新的 miRNAs。其中,bna-miR482a、bna-miR408a-5p、bna-miR408b-5p、bna-miR165a-5p、bna-miR165b-5p、bna-miR398-5p 和bna-miR160a-3p在突变体中上调表达,bna-miR827a下调表达。新预测的miRNA中,2个上调表达,4个下调表达。5.差异表达miRNA靶基因预测。Bna-miR165a-5p在蜡质缺失突变体中上调表达,但是通过qRT-PCR检测,其预测靶基因BnaA06g40560D在突变体中下调表达;bna-miR827a在突变体中下调表达,其4个靶基因（BnaC08g45940D、BnaA09g51130D、BnaA10g01450D和BnaC05g01480D）在突变体中上调表达。并且,5’-RACE结果显示,bna-miR827a对BnaC08g45940D、BnaA10g01450D和BnaC05g01480D的转录本进行切割。6.Bn.YCO突变体基因编辑及表型鉴定。Bn.YCO是一个功能未知基因,利用CRISPR/Cas9技术在油菜中同时敲除两个拷贝BnaA01.YCO（BnaA01g00180D）和BnaC01.YCO（BnaC01g01100D）。转基因阳性植株叶片为花斑状,叶绿素含量降低,叶绿素合成基因下调表达。靶位点测序后发现,在花斑状植株中,Bn.YCO两个拷贝发生不同类型的碱基插入缺失突变。T1代Bn.yco突变体呈现子叶黄化、真叶为花斑状或白化表型。7.叶绿体透射电镜观察。花斑状叶片中,叶绿体形态异常,无法观察到内部的类囊体膜结构。播种后7天的黄化子叶中,叶绿体结构内部没有类囊体膜。在播种后14天的突变体子叶中,叶绿体疑似已经被降解,并且观察到质体小球聚集。8.Bn.YCO编码叶绿体定位蛋白。将YCO蛋白序列提交到NCBI和Phytozome 7.0数据库搜索其同系物,得到了 19个不同物种的序列高度相似的同系物。分析发现,YCO序列N端的叶绿体信号肽序列和靠近C端序列保守性低,其余序列高度保守。亚细胞定位结果显示,Bn.YCO在叶绿体中表达。9.Bn.YCO表达模式分析。取油菜茎秆、叶片、花、角果和不同发育时期的子叶为材料,qRT-PCR检测Bn.YCO的表达。结果显示,Bn.YCO在叶片中表达量相对较高,在根和角果中几乎检测不到其表达。在发芽后1天和2天的子叶中,Bn.YCO的表达量升高,在发芽后3天的子叶中,表达量下降至与萌发期基本持平。GUS染色结果验证了上述的表达模式。10.叶绿体基因转录水平分析。突变体中大部分叶绿体基因的mRNA水平显著下降,例如核基因编码RNA聚合酶（NEP）转录依赖型基因rpoA,质体基因编码RNA聚合酶（PEP）转录依赖型基因psaB、psbB和petA,以及NEP和PEP转录依赖型基因atpA、atpB和atpE等。说明,Bn.yco突变影响叶绿体基因的转录。11.Bn.yco突变体黄化子叶和野生型绿色子叶转录组分析。在突变体中,共有7,740个基因上调表达,10,831个基因下调表达。差异表达基因聚类分析发现,参与核糖体组装过程的基因表达水平显著下降。此外,光合系统蛋白编码基因也显著下调表达。说明Bn.yco突变显著影响叶绿体蛋白的翻译过程和光合作用过程。