胰腺癌(pancreatic carcinoma)是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤之一,其恶性程度极高而且发病隐匿,难以早期诊断和治疗,临床确诊者大多属于晚期癌。胰腺癌的预后极差,5年生存率总体低于5%。除早期手术外,尚无其他有效治疗措施,而且由于很难早期诊断,只有大约14%的患者可以选择手术治疗。近年来胰腺癌发生率在国内外均呈逐年上升趋势,据报道,近十年发病率上升了3-7倍。1991年,Hrudan等统计,胰腺癌是美国地区肿瘤死亡原因的第四位,仅次于肺癌,结肠癌和乳腺癌。在我国,随着人们生活水平的提高,饮食结构的变化,胰腺癌的发病率从1980年的第二十上升到第五位。上海疾控中心2000年统计的胰腺癌发病率为每十万人有6人发病,其中5.5人死亡,发病率几乎接近于死亡率,这一数字触目惊心。一般认为,肿瘤发生是由于细胞生长调控机制紊乱造成的。正常细胞生长增殖是由两大类基因调控的,一类是正调控信号,促进细胞生长和增殖,并阻止其发生终末分化,现知多数癌基因(oncogene)属此类。另一类为负调控信号,促进细胞成熟,向终末分化,抗癌基因(anti-oncogene)可能发挥这方面的作用。这两种信号保持着动态平衡,对正常细胞生长、增殖和死亡进行精确的调控。一旦两者之间的正常关系被破坏,则会使细胞的调控紊乱从而造成细胞恶变。Ras基因定位于1lq13,其基因家族包括H—ras、K-ras和N—ras。K-ras基因编码的蛋白是位于细胞膜上的鸟苷酸结合蛋白,负责将外部信号转导到细胞内部。其编码的K-ras p21 ras蛋白具有GTP酶活性,突变可导致ras蛋白失去GTP酶活性,GTP处于持续激活状态,细胞在持续激活的信号传导刺激下不断增殖,发生癌变。胰腺癌K-ras基因的第一外显子第12密码子点突变已被证实是胰腺肿瘤发生的早期事件,是早期诊断胰腺癌的重要指标。K-ras基因在胰腺癌中的突变率平均在80%左右,其中以12密码子突变最为常见。第12位密码子的点突变又以GAT (46%), GTT(32%),和CGT (13%)三种形式最为多见。有研究表明抑制突变K-ras的表达,可有效抑制胰腺癌细胞的生长。RNA干扰(RNA interference)技术是一项近年来发现的抑制基因表达的新技术,由于其具有特异性强,效率高等优点而成为在肿瘤研究中的热点。本实验根据突变的K-ras基因序列构建针对两种胰腺癌细胞株的特异性的shRNA质粒载体pGenesil-1-P1, pGenesil-1-M2及阴性对照pGenesil-1-HK。观察RNA干扰用于K-ras基因突变型胰腺癌的治疗效果,并验证两种非特异性的shRNA序列对不同胰腺癌细胞是否有交叉抑制作用,为胰腺癌的基因治疗寻找新的途径。目的:研究短发夹RNA(shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1和Miapaca-2中突变型K-ras基因表达的抑制作用,以及两shRNA片段对非特异胰腺癌细胞是否具有交叉抑制作用。方法:1构建针对PANC-1细胞中突变型K-ras基因的重组质粒载体pGenesil-1-P1,以及针对Miapaca-2细胞中突变型K-ras基因的重组质粒载体pGenesil-1-M2,阴性对照质粒pGenesil-1-HK。2细胞培养,并应用脂质体2000将重组质粒pGenesil-1-P1转染到胰腺癌细胞PANC-1,重组质粒载体pGenesil-1-M2转染到胰腺癌细胞Miapaca-2中。以及将两重组质粒载体交叉转染两胰腺癌细胞。3提取转染48小时后的细胞RNA,总蛋白,应用RT-PCR,免疫印迹(western blotting )法检测RNA干扰对胰腺癌细胞突变型K-ras基因表达的影响。4应用CCK-8法测量细胞生长曲线。结果:测序证明质粒载体构建成功,通过荧光显微镜观察到重组质粒转染成功转染到胰腺癌细胞,RT-PCR产物的琼脂糖电泳结果以及western结果显示特异性转染组的mRNA及蛋白的表达均减少(p<0.05),而非特异性转染组的K-ras基因的mRNA及蛋白的表达均未见明显变化。应用CCK-8方法检测细胞生长曲线显示特异性转染组细胞的生长受到明显抑制(p<0.05),而非特异性转染组的细胞的生长未受到明显抑制。结论:特异性shRNA重组质粒转染胰腺癌细胞后,胰腺癌细胞突变型K-ras基因的mRNA及蛋白的表达以及细胞的生长受到抑制,而非特异性转染和阴性对照质粒的胰腺癌细胞的mRNA及蛋白的表达以及细胞的生长未受到抑制。