生理条件下，血细胞的生长、增殖、分化和凋亡受体内两大类正负调控因子网络的调控；正调控因子刺激血细胞生长和增殖，负调控因子抑制血细胞增殖、诱导细胞凋亡。白血病的本质特征是血细胞过度增殖，分化和凋亡受阻。正负调控因子网络失衡在其发病机制中可能发挥重要作用。TGF-β是造血系统中最重要的负调控因子之一，以自分泌或旁分泌方式通过细胞表面受体抑制血细胞增殖、诱导血细胞凋亡。本课题组前期研究发现：白血病原代细胞及细胞系（HL-60、Molt-4、K562）存在内源性TGF-β₁表达水平缺陷；通过向白血病细胞HL-60中导入外源性TGF-β₁基因，我们发现（导入的）外源性TGF-β₁基因的表达能够纠正这种缺陷，并且抑制HL-60细胞的增殖、诱导其细胞凋亡。提示TGF-β₁表达缺陷参与白血病发病过程。基于TGF-β₁在白血病发病中的可能作用，我们还研究了TGF-β受体（TGF-βreceptor，TβR）在白血病发病中的作用，特别是TβRⅡ在白血病中的表达与调控，在国际上首先发现白血病细胞中存在两种TβRⅡ的异构体，即TβRⅡA和TβRⅡB；且这两种异构体在白血病细胞与正常人造血干细胞的表达水平不同，即在白血病细胞以TβRⅡB为主，而在正常人造血干细胞以TβRⅡA为主。TβRⅡ这两种异构体的功能是否存在差异，目前尚不清楚。基于此，本课题以低表达TβRⅡ的白血病细胞株HL-60和Molt-4细胞为靶细胞，分别构建含有TβRⅡA或TβRⅡB基因的真核表达载体，并获得稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞，进而研究外源TGF-β₁对它们增殖、凋亡的影响及其机制。本文的研究内容主要分为以下三部分：1.稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞株的建立（1）采用电穿孔的方法，分别将重组表达质粒pEFIRES-N-TβR Ⅱ A或pEFIRES-N-TβRⅡB转染HL-60和Molt-4细胞，用抗生素筛选出稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞株。（2）利用RT-PCR、Western-Blot鉴定抗性细胞中TβRⅡA和TβRⅡB的表达情况。2.稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞的体外生物学特性研究（1）利用细胞计数法检测TGF-β₁对稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞的增殖的影响。（2）利用流式细胞仪，结合AO/EB法检测TGF-β₁对稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞的凋亡的影响。（3）利用流式细胞仪检测TGF-β₁对稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞的周期的影响。（4）利用实时定量PCR检测TGF-β₁对稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞中的癌基因（bcl-2、c-myc、s100a6、p34）、抑癌基因（p21、p27）和TGF-β信号通路基因（TβRⅠ、Smad4、Smad7）的表达的影响。（5）利用Western-Blot方法检测TGF-β₁对稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞中的C-myc、Bcl-2、Smad2、Smad3、Smad4等蛋白的表达的影响。3.稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60细胞在裸鼠体内增殖情况的研究利用裸鼠异种移植瘤模型，研究稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤和增殖的情况。取得了以下主要结果：1.成功获得稳定表达TβRⅡA或TβRⅡB的HL-60细胞和Molt-4细胞株，分别命名为：HL-60/pEFIRES-N细胞（转染pEFIRES-N空质粒的HL-60细胞）、HL-60/TβR Ⅱ A细胞（转染pEFIRES-N-TβR Ⅱ A重组质粒的HL-60细胞）、HL-60/pEFIRES-P细胞（转染pEFIRES-P空质粒的HL-60细胞）、HL-60/TβRⅡB细胞（转染pEFIRES-P-TβRⅡB重组质粒的HL-60细胞）、Molt-4/pEFIRES-N细胞（转染pEFIRES-N空质粒的Molt-4细胞）、Molt-4/TβRⅡA细胞（转染pEFIRES-N-TβRⅡA重组质粒的Molt-4细胞）、Molt-4/pEFIRES-P细胞（转染pEFIRES-P空质粒的Molt-4细胞）和Molt-4/TβRⅡB细胞（转染pEFIRES-P-TβRⅡB重组质粒的Molt-4细胞）。2.细胞计数法检测细胞增殖结果表明：与对照组相比，在0ng/ml～12ng/ml的浓度范围内，TGF-β₁对HL-60/TβR ⅡA细胞的增殖抑制作用增强，并呈现时间及剂量依赖性，而对HL-60/TβR Ⅱ B细胞不产生明显的增殖抑制作用。与此类似，与对照组相比，在0ng/ml～20ng/ml的浓度范围内，TGF-β₁对Molt-4/TβR ⅡA细胞的增殖抑制作用增强，并呈现时间及剂量依赖性，而对Molt-4/TβR Ⅱ B细胞的增殖抑制作用没有Molt-4/TβR Ⅱ A细胞明显。3.细胞凋亡检测结果表明：与对照组相比，在0ng/ml～12ng/ml的浓度范围内，TGF-β₁对HL-60/TβR ⅡA细胞的促凋亡作用增强，并呈现时间及剂量依赖性；当10ng/ml TGF-β₁处理24小时后，HL-60/TβRⅡA细胞的总凋亡率为2.34%，高于HL-60/TβRⅡB细胞的0.08%和HL-60细胞的0.06%；当10ng/ml TGF-β₁处理时间延长到96小时后，HL-60/TβRⅡA细胞的凋亡细胞比例为28.26%，高于HL-60/TβRⅡB细胞的21.44%和HL-60细胞的6.09%。与此类似，在0ng/ml～20ng/ml的浓度范围内，TGF-β₁对Molt-4/TβR ⅡA细胞的促凋亡作用呈现时间及剂量依赖性；当12ng/ml TGF-β₁处理24小时后，Molt-4/TβRⅡA细胞的总凋亡率为2.98%，高于Molt-4/TβRⅡB细胞的1.80%和Molt-4细胞的0.16%；当12ng/mlTGF-β₁处理时间延长到72小时后，Molt-4/TβRⅡA细胞总凋亡率为74.63%，显著高于Molt-4/TβRⅡB细胞的48.82%和Molt-4细胞的17.88%。4.流式细胞仪检测细胞周期结果表明，10ng/ml的TGF-β₁作用24～96小时后，与其它各组细胞相比，HL-60/TβRⅡA细胞中进入S期的细胞比率降低，进入G1期的细胞升高。并且HL-60/TβRⅡA细胞与其它组的差异随着处理时间的延长而增加。TGF-β₁作用24小时后，HL-60/TβRⅡA细胞中进入S期的比例为47.51%，略低于HL-60细胞的55.46%和HL-60/TβRⅡB细胞的51.92%；TGF-β₁作用96小时后，HL-60/TβRⅡA细胞中进入S期的比例仅为20.20%，明显低于HL-60细胞的58.35%和HL-60/TβRⅡB细胞的56.22%。与此类似，当12ng/ml的TGF-β₁作用24～96小时后，与其它各组细胞相比，Molt-4/TβRⅡA细胞中进入S期的细胞比率降低，进入G1期的细胞升高。在TGF-β₁作用24小时后，Molt-4/TβRⅡA细胞中进入S期的比例为32.58%，略低于Molt-4细胞的41.77%和Molt-4TβRⅡB细胞的36.83%；TGF-β₁作用72小时后，Molt-4/TβRⅡA细胞中进入S期的比例仅为25.64%，明显低于Molt-4细胞的49.87%和Molt-4/TβRⅡB细胞的34.01%。5.实时定量PCR检测结果显示，10ng/ml TGF-β₁作用96小时后，能够在HL-60/TβRⅡA细胞中显著下调bcl-2、c-myc、p34表达，显著上调p21表达；而对HL-60/TβRⅡB和HL-60细胞的bcl-2、c-myc仅轻度下调，p21、p34表达无变化；TβRⅠ、Smad4、Smad7、s100a6、p27等基因在HL-60/TβRⅡA、HL-60/TβRⅡB和HL-60细胞中均无变化。12ng/ml TGF-β₁作用72小时后，能够在Molt-4/TβRⅡA细胞中显著下调c-myc的表达，显著上调p21、p27表达；对Molt-4/TβRⅡB细胞c-myc的下调程度，p21、p27的上调程度不如Molt-4/TβRⅡA细胞；Molt-4细胞c-myc、p21、p27无变化；TβRⅠ、Smad4、Smad7等基因在Molt-4/TβRⅡA、Molt-4/TβRⅡB和Molt-4细胞中均无变化；此外，利用荧光定量方法检测不到bcl-2、s100a6、p34在各组Molt-4细胞中的表达。6. Western-Blot检测结果显示，在体外10ng/ml TGF-β₁作用96小时后，能够显著下调Bcl-2、C-myc蛋白在稳定表达HL-60/TβRⅡA的细胞中的表达，Smad2、Smad3、Smad4的表达无明显差异；而在HL-60/TβRⅡB细胞中上述蛋白均无明显变化。在体外12ng/ml TGF-β₁作用72小时后，能够显著下调Bcl-2和C-myc蛋白在Molt-4/TβRⅡA和Molt-4/TβRⅡB细胞中的表达，但是它们在Molt-4/TβRⅡA细胞中的下调趋势更为显著；此外，Smad2、Smad3、Smad4的表达在Molt-4/TβRⅡA和Molt-4/TβRⅡB细胞均无明显差异。7.裸鼠体内致瘤实验结果显示，对照组HL-60/pEFIRES-N和HL-60/pEFIRES-P细胞、实验组HL-60/TβRⅡA和HL-60/TβRⅡB细胞，它们在裸鼠体内平均成瘤时间分别为8.25天、8.88天、12.38天、10.25天，实验组和对照组相比成瘤时间明显延长；接种22天后各组瘤块平均体积分别为5.39±2.67cm3、5.15±2.87cm3、1.18±1.12cm3、3.31±2.37cm3，实验组和对照组相比瘤块体积显著减小（p＜0.05）；同时各组瘤块平均重量分别为3.54±1.84g、3.46±1.61g、0.98±0.74g、2.15±1.43g，实验组和对照组相比瘤块重量显著减轻（p＜0.05）。并且，与HL-60/TβRⅡB细胞相比，HL-60/TβRⅡA细胞在裸鼠体内增殖能力明显减弱。结论：TβRⅡA和TβRⅡB在功能上存在差异，稳定表达TβRⅡA的HL-60和Molt-4细胞对TGF-β₁的敏感性提高，其在细胞增殖抑制及促凋亡作用均较稳定表达TβRⅡB的HL-60和Molt-4细胞明显。鉴于在白血病细胞中的表达以TβRⅡB为主，而在正常人造血干细胞以TβRⅡA为主，推测TβRⅡ异常表达可能参与白血病的发病过程。