研究背景和目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌)是一种恶性程度高、预后差的肿瘤,5年生存率不足5%。肝癌在全世界范围内约占全部人类恶性肿瘤的5.6%,其中我国肝癌发生率约为30.3/10万,每年约有14万人死于肝癌,约占全世界肝癌死亡人数的45%左右,特别是广西扶绥县和江苏启东县有较高的发病率。肝癌的病因和发生机制尚不完全清楚,由于尚缺乏理想的肝癌实验动物模型使肝癌的病因、发病机制及其防治的研究受到很大的局限。自20世纪初人类获得小鼠自发性肝癌动物模型以来,已有多种动物被用于建立肝癌动物模型,例如鼠、兔、犬、树鼩等。目前建立肝癌动物模型的主要有自发性肝癌模型、诱发性肝癌模型、移植型肝癌模型、转基因肝癌模型等。其中诱发型和移植型应用广泛。移植性肝癌动物模型具有造模时间短、成活率高、易成功、肿瘤位置易控制、模型简单等优点,但其不具备与人类肝癌发生的类似过程,因而不能很好的用于研究人类肝癌发生发展。诱发性小鼠肝癌模型因能较好地模仿人肝癌过程,是目前常用的肝癌动物模型。常用的化学诱导药物有芳香胺类化合物、亚硝胺及黄曲霉素类等,但黄曲霉毒素B1诱癌周期长,需12-18个月,故现已很少用。现在最为常用的是亚硝胺类的二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)。近年来转基因动物在国内外肝癌动物模型的研究中发展很快,成为动物实验研究的热点。绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)转基因小鼠就是转基因动物中的一员。虽然GFP转基因小鼠在骨髓间充质干细胞、皮肤成纤维细胞、骨髓基质细胞、神经干细胞等领域进行了广泛的研究,但是GFP转基因小鼠在诱导肝癌方面目前尚未见报道。本研究拟用DEN/ccl4/乙醇/DEN联合诱导建立GFP转基因小鼠肝癌模型；并探讨GFP转基因小鼠诱癌过程中荧光的变化。方法6-9周龄雄性GFP转基因小鼠(体重27.71±1.88g)60只,随机分成2组：DEN/ccl4/乙醇/DEN组(实验组)50只,对照组10只。实验组GFP转基因小鼠第一周首先按100mg/kg腹腔注射DEN一次；第二周不予用药；第3-7w,5%ccl4灌胃0.05mL/10g,2次/w；ccl4灌胃后第3-20周给9%乙醇水自由饮用；第8-12周实验组10%ccl。灌胃,0.05mL/10g,2次/w；第13-15周实验组20%ccl4灌胃,0.05mL/10g,2次/w；第16周给予50mg/kg腹腔注射DEN一次；17-20周不予用药。对照组在实验第一周腹腔注射与DEN溶液等量的生理盐水。第3-15周生理盐水灌胃,第16周腹腔注射生理盐水,给予三蒸水和高压饲料饲养。实验共进行20周。每周监测体重的变化；第4、12、16周处死小鼠取肝组织制作冰冻切片观察荧光表达；病理常规HE染色动态观察；第20周时处死小鼠取其肝肿物进行原代培养,观察肿瘤细胞中的荧光的表达和分布；取20周小鼠的同一肝脏肿物在无菌的条件下移植到裸鼠体内,观察肿物在裸鼠体内荧光的表达情况。结果实验组GFP转基因小鼠死亡15只,死亡率是30%(15/50)。对照组10小鼠未发生死亡。第20周时实验组GFP转基因小鼠肝癌发生率为77.14%(27/35),对照组无肝癌发生。GFP转基因小鼠在诱癌的第4、12、16、20周依次出现了肝炎,肝硬化、癌前病变、癌变的表现,与人类原发性肝癌的发生发展相似。荧光显微镜下观察到从诱癌开始前、第4周、第12周、第16周、第20周肝脏组织的冰冻切片均有GFP的表达。诱癌第20周肝肿物原代培养中肿瘤细胞的胞浆和细胞核中有GFP表达。移植肝癌实验在观察1.5个月时荧光在裸鼠体内一直持续表达,呈一种高表达状态。但在1.5个月后肿瘤突然变小,两个月时肿瘤彻底消失。结论采用DEN/ccl4/乙醇/DEN诱癌剂可以构建GFP转基因小鼠的肝癌动物模型,在造模过程中绿色荧光蛋白始终保持在肝细胞或肝癌细胞中。为今后肝癌的研究提供了一个较为理想的模型。