CRISPR/Cas9文库介导的全基因组筛选技术简单高效,已经被广泛地应用于病毒宿主因子筛选、肿瘤药物靶点筛选以及免疫因子筛选等多个研究领域。目前CRISPR/Cas9文库转染多数是由病毒载体介导的,而病毒文库在体内直接进行筛选受到诸多限制,因为它存在制备步骤繁琐、对实验条件要求高、具有安全风险、具有免疫原性、转染细胞类型受限等一系列问题。因此,开发一种新型的可以应用于体外和体内筛选的CRISPR/Cas9文库系统对于促进生命科学的发展具有非常重要的意义。本研究将CRISPR/Cas9技术与递送系统piggyBac（PB）转座子进行结合,创建了高效的基因打靶系统,并且在此基础上构建了靶向小鼠全基因组的PB-CRISPR/Cas9文库系统。首先,本研究以打靶小鼠Tet1、Tet2和Tet3基因为例,验证了 PB-CRISPR/Cas9打靶系统的有效性;随后,利用芯片合成技术合成了靶向小鼠全基因组的单链向导RNA（Single guide RNA,sgRNA）序列文库（文库靶向20611个编码基因和1175个microRNAs,针对每个基因设计了 4-6个sgRNAs,此外,文库中还包含1000条无意义的sgRNAs作为筛选成功与否的参考,共计130209条sgRNAs）,将其克隆到PB载体上获得了 PB-CRISPR/Cas9文库系统;对文库进行高通量测序分析发现,构建的文库中sgRNAs的数量占芯片合成文库的94.5%,并且在各染色体上均匀分布。结果证明PB-CRISPR/Cas9文库构建成功。为了验证PB-CRISPR/Cas9文库是否可以在体外进行高效稳定的筛选,本研究利用文库系统在小鼠胚胎干细胞中进行了多能性维持负调控因子的筛选。通过对Nanog-GFP报告系统的小鼠胚胎干细胞进行文库转染和严格筛选,获得了可以在分化培养基中长期传代的细胞;多能性因子的免疫荧光染色以及多能性基因表达检测结果表明,这些细胞仍然维持在多能性状态;对这些细胞中sgRNAs进行高通量测序分析发现,5次重复实验均得到了 Tcf7l1、Csnkla1、Socs3和Flcn等与干细胞自我更新维持相关的负调控因子。结果证明本研究创建的PB-CRISPR/Cas9文库能够在体外高效稳定地进行规模化筛选。为了验证PB-CRISPR/Cas9文库在体内环境下进行筛选的可行性,本研究利用文库系统在小鼠活体内进行了肝脏肿瘤抑制因子的筛选。通过尾静脉注射的方法将文库载体和肿瘤诱导背景载体(hNras（il2V过表达以及Cdkn2a敲除）转入到3-4周龄野生型ICR公鼠的肝脏细胞中,45-60天后实验小鼠产生了肝脏肿瘤;苏木精伊红染色和肿瘤标志蛋白的免疫组化染色结果表明,这些肿瘤大多数为肝内小胆管上皮细胞来源的肝内胆管细胞癌;对肝脏中的sgRNAs进行高通量测序分析,得到了Trp53、Cdkn2b、Parm1和Sel1l2等与肝脏肿瘤发生相关的肿瘤抑制因子。结果证明PB-CRISPR/Cas9文库可以在体内直接进行筛选应用。综上所述,本研究创建了靶向小鼠全基因的PB-CRISPR/Cas9文库系统,利用该文库系统在小鼠胚胎干细胞中筛选获得了多能性维持负调控因子,并且在活体小鼠肝脏中筛选获得了肝脏肿瘤抑制因子,体外和体内的结果均证明PB-CRISPR/Cas9文库系统筛选高效,应用便捷。这一系统的建立为今后在体内外的筛选提供了新的选择和思路。