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阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种以进行性痴呆为临床特征的神经退行性疾病，常见于老年人，其主要的病理特征包括β-淀粉样蛋白(β-Amyloidprotein，Aβ)沉积形成的老年斑、tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)、以及突触和特定脑区选择性胆碱能神经元丢失。糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，按照发病原因可以分为Ⅰ型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)和Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)。大量的临床流行病学研究发现，T1DM和T2DM均会对患者的认知能力和记忆能力造成损伤。有DM阳性病史的人群，其AD的发病率明显增高，并且DM的发病越早罹患AD的风险越高。此外，尸检结果显示，DM患者胰腺和脑内均可检测到Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化，且同时患有DM和AD的患者其病变更为明显。因此，近期有学者将AD称为“Ⅲ型糖尿病”，以此来强调二者之间的内在关系。然而，由于缺乏可靠的动物模型，关于胰岛素抵抗和高血糖对老年斑的形成及对tau蛋白过度磷酸化的影响尚不明确。DM和AD之间是否存在互作关系有待深入探讨。
本研究利用瘦素基因缺失(ob/ob+/-)小鼠与APP/PS1转基因小鼠进行杂交，获得WT(Wild-type)、ob/ob、APP/PS1和APP/PS1-ob/ob四种基因型小鼠。其中，APP/PS1-ob/ob小鼠为患有T2DM和AD双重病症的动物模型。采用行为学、形态学和分子生物学等手段，探讨胰岛素抵抗所致T2DM促进小鼠脑内Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经元丢失以及降低小鼠学习记忆能力的机制，并分析脑内胰岛素抵抗介导的炎症性免疫反应与AD样大脑病理性改变的关系。
既往的研究证实，瘦素基因缺失小鼠能够作为T2DM的可靠动物模型，其主要表现为由胰岛素抵抗引起的慢性高血糖症状。为了进一步证实该模型小鼠的T2DM特征，本研究对3月龄各基因型小鼠体内葡萄糖和胰岛素代谢进行了检测。血糖监测结果显示，ob/ob和APP/PS1-ob/ob小鼠表现出明显的高血糖特征。葡萄糖耐量实验(Glucose tolerance test，GTT)和胰岛素耐量实验(Insulin tolerance test，ITT)结果说明，瘦素缺失的APP/PS1小鼠表现出明显的胰岛素抵抗的T2DM症状。胰岛素检测结果显示，相比于WT小鼠和APP/PS1小鼠，ob/ob和APP/PS1-ob/ob小鼠血清和脑内的胰岛素水平明显增加。说明瘦素基因缺失所引起的高血糖是由于胰岛素抵抗而并非胰岛素缺乏所致。以上结果显示，APP/PS1-ob/ob小鼠能够表现出明显胰岛素抵抗的T2DM症状，可以作为探讨T2DM和AD关系的重要动物模型。
为了探讨T2DM对于APP/PS1小鼠记忆及认知功能的影响，本研究利用Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)和筑巢实验对6月龄小鼠的行为表现进行了评价。MWM结果显示，APP/PS1-ob/ob小鼠在空间探索实验过程中的逃避潜伏期与其它各组小鼠相比显著增长，逃脱路程增加。筑巢实验也进一步证实了APP/PS1-ob/ob小鼠认知功能障碍。行为学实验结果提示，慢性高血糖能够加重APP/PS1小鼠的记忆及认知损伤。
在进一步的研究中，我们探讨了T2DM对于AD小鼠脑内APP代谢的影响，我们利用形态学和免疫印迹的方法对APP剪切酶及其代谢产物和Aβ沉积进行了检测。研究发现，APP/PS1-ob/ob小鼠脑内老年斑的数量和面积均显著高于APP/PS1小鼠。此外，Westernblot结果显示，T2DM能够诱导APP表达增加，α-分泌酶及其剪切产物sAPPα和CTFα表达下降。以上结果说明，T2DM可能促进了APP代谢的淀粉样生成途径，加重Aβ产生和沉积。
Tau蛋白过度磷酸化和突触损伤是AD早期病理的主要表现。为了探讨慢性T2DM对AD小鼠脑内神经原纤维缠结和突触损伤的影响，本研究利用免疫组织化学和免疫印迹法对小鼠脑内多个tau磷酸化位点和突触表达进行了检测。结果显示，慢性高糖环境能够诱导APP/PS1小鼠脑内Ser396、Ser202和Thr231位点的tau磷酸化水平增加，从而介导突触标志蛋白突触素(Synaptophysin，SYP)、N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl-D-aspartate receptor 2B subunit，NMDAR2B)和突触后密度蛋白95(Postsynaptic density protein 95，PSD95)的表达下降，引起突触功能损伤。在对tau磷酸化和突触损伤机制的研究中发现，相比于APP/PS1小鼠，APP/PS1-ob/ob小鼠脑内周期性依赖蛋白激酶-5(Cyclin-dependent kinase-5，CDK5)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin，mTOR)的磷酸化程度增加，且CREB的活性受到抑制，这一过程受到钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmoduli-dependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)和钙蛋白酶1(calpain1)的调控。因此，我们利用原子吸收光谱法对小鼠脑内钙含量进行了检测。结果显示，T2DM能够显著增加AD小鼠脑内钙含量，引起钙超载。以上结果提示，慢性胰岛素抵抗可能通过诱导线粒体功能紊乱引起钙稳态失衡，从而激活CDK5/calpain1和CAMKⅡ/mTOR通路，促进tau蛋白磷酸化和突触损伤加剧。
炎症反应是Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化所引起的脑内继发性免疫反应。因此，为了深入探究慢性高血糖对AD小鼠脑内炎症性免疫反应的影响，我们对小鼠大脑的ROS及炎症相关通路进行了检测。研究发现，瘦素基因缺失后，APP/PS1小鼠脑内晚期糖基化终末端产物(Advanced glycation end-product，AGEs)/晚期糖基化终末端产物受体(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)及下游细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)/核因子κB(Nuclearfactor-kappaB，NFκB)通路被进一步激活，诱导ROS产生增加。此外，Westernblot及RT-PCR结果显示，T2DM能够显著增加AD小鼠脑内白介素-1β(Interleukin1β，IL-1β)、白介素-6(Interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactorα，TNFα)等促炎因子的表达。Aβ/GFAP和Aβ/Iba1荧光共定位实验的实验结果与之相符，相比于APP/PS1小鼠，APP/PS1-ob/ob小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的激活程度更高。该实验结果提示，慢性高血糖可能通过激活AGEs/RAGE及下游ERK/NFκB通路，诱导AD小鼠脑内的炎症反应进一步加剧。
综上所述，瘦素基因缺失所致T2DM能够抑制APP/PS1小鼠脑内的非淀粉样生成途径，从而诱导Aβ产生和积累增加;同时，T2DM能够诱导APP/PS1小鼠脑内钙含量升高，激活钙相关蛋白激酶calpain1和CAMKⅡ，从而促进tau蛋白过度磷酸化和突触损伤加剧;此外，慢性胰岛素抵抗能够激活APP/PS1小鼠脑内AGEs/RAGE及其下游ERK/NFκB通路，介导炎症和细胞凋亡增加。在瘦素缺失所致的慢性高糖环境下，以上病理特征的恶化共同导致了APP/PS1小鼠记忆及认知功能加剧。本项目的实施对指导T2DM人群预防AD的发生和发展以及寻找AD防治的新靶点具有重要的理论意义。
本研究利用瘦素基因缺失(ob/ob+/-)小鼠与APP/PS1转基因小鼠进行杂交，获得WT(Wild-type)、ob/ob、APP/PS1和APP/PS1-ob/ob四种基因型小鼠。其中，APP/PS1-ob/ob小鼠为患有T2DM和AD双重病症的动物模型。采用行为学、形态学和分子生物学等手段，探讨胰岛素抵抗所致T2DM促进小鼠脑内Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经元丢失以及降低小鼠学习记忆能力的机制，并分析脑内胰岛素抵抗介导的炎症性免疫反应与AD样大脑病理性改变的关系。
既往的研究证实，瘦素基因缺失小鼠能够作为T2DM的可靠动物模型，其主要表现为由胰岛素抵抗引起的慢性高血糖症状。为了进一步证实该模型小鼠的T2DM特征，本研究对3月龄各基因型小鼠体内葡萄糖和胰岛素代谢进行了检测。血糖监测结果显示，ob/ob和APP/PS1-ob/ob小鼠表现出明显的高血糖特征。葡萄糖耐量实验(Glucose tolerance test，GTT)和胰岛素耐量实验(Insulin tolerance test，ITT)结果说明，瘦素缺失的APP/PS1小鼠表现出明显的胰岛素抵抗的T2DM症状。胰岛素检测结果显示，相比于WT小鼠和APP/PS1小鼠，ob/ob和APP/PS1-ob/ob小鼠血清和脑内的胰岛素水平明显增加。说明瘦素基因缺失所引起的高血糖是由于胰岛素抵抗而并非胰岛素缺乏所致。以上结果显示，APP/PS1-ob/ob小鼠能够表现出明显胰岛素抵抗的T2DM症状，可以作为探讨T2DM和AD关系的重要动物模型。
为了探讨T2DM对于APP/PS1小鼠记忆及认知功能的影响，本研究利用Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)和筑巢实验对6月龄小鼠的行为表现进行了评价。MWM结果显示，APP/PS1-ob/ob小鼠在空间探索实验过程中的逃避潜伏期与其它各组小鼠相比显著增长，逃脱路程增加。筑巢实验也进一步证实了APP/PS1-ob/ob小鼠认知功能障碍。行为学实验结果提示，慢性高血糖能够加重APP/PS1小鼠的记忆及认知损伤。
在进一步的研究中，我们探讨了T2DM对于AD小鼠脑内APP代谢的影响，我们利用形态学和免疫印迹的方法对APP剪切酶及其代谢产物和Aβ沉积进行了检测。研究发现，APP/PS1-ob/ob小鼠脑内老年斑的数量和面积均显著高于APP/PS1小鼠。此外，Westernblot结果显示，T2DM能够诱导APP表达增加，α-分泌酶及其剪切产物sAPPα和CTFα表达下降。以上结果说明，T2DM可能促进了APP代谢的淀粉样生成途径，加重Aβ产生和沉积。
Tau蛋白过度磷酸化和突触损伤是AD早期病理的主要表现。为了探讨慢性T2DM对AD小鼠脑内神经原纤维缠结和突触损伤的影响，本研究利用免疫组织化学和免疫印迹法对小鼠脑内多个tau磷酸化位点和突触表达进行了检测。结果显示，慢性高糖环境能够诱导APP/PS1小鼠脑内Ser396、Ser202和Thr231位点的tau磷酸化水平增加，从而介导突触标志蛋白突触素(Synaptophysin，SYP)、N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-methyl-D-aspartate receptor 2B subunit，NMDAR2B)和突触后密度蛋白95(Postsynaptic density protein 95，PSD95)的表达下降，引起突触功能损伤。在对tau磷酸化和突触损伤机制的研究中发现，相比于APP/PS1小鼠，APP/PS1-ob/ob小鼠脑内周期性依赖蛋白激酶-5(Cyclin-dependent kinase-5，CDK5)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin，mTOR)的磷酸化程度增加，且CREB的活性受到抑制，这一过程受到钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmoduli-dependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)和钙蛋白酶1(calpain1)的调控。因此，我们利用原子吸收光谱法对小鼠脑内钙含量进行了检测。结果显示，T2DM能够显著增加AD小鼠脑内钙含量，引起钙超载。以上结果提示，慢性胰岛素抵抗可能通过诱导线粒体功能紊乱引起钙稳态失衡，从而激活CDK5/calpain1和CAMKⅡ/mTOR通路，促进tau蛋白磷酸化和突触损伤加剧。
炎症反应是Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化所引起的脑内继发性免疫反应。因此，为了深入探究慢性高血糖对AD小鼠脑内炎症性免疫反应的影响，我们对小鼠大脑的ROS及炎症相关通路进行了检测。研究发现，瘦素基因缺失后，APP/PS1小鼠脑内晚期糖基化终末端产物(Advanced glycation end-product，AGEs)/晚期糖基化终末端产物受体(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)及下游细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)/核因子κB(Nuclearfactor-kappaB，NFκB)通路被进一步激活，诱导ROS产生增加。此外，Westernblot及RT-PCR结果显示，T2DM能够显著增加AD小鼠脑内白介素-1β(Interleukin1β，IL-1β)、白介素-6(Interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactorα，TNFα)等促炎因子的表达。Aβ/GFAP和Aβ/Iba1荧光共定位实验的实验结果与之相符，相比于APP/PS1小鼠，APP/PS1-ob/ob小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的激活程度更高。该实验结果提示，慢性高血糖可能通过激活AGEs/RAGE及下游ERK/NFκB通路，诱导AD小鼠脑内的炎症反应进一步加剧。
综上所述，瘦素基因缺失所致T2DM能够抑制APP/PS1小鼠脑内的非淀粉样生成途径，从而诱导Aβ产生和积累增加;同时，T2DM能够诱导APP/PS1小鼠脑内钙含量升高，激活钙相关蛋白激酶calpain1和CAMKⅡ，从而促进tau蛋白过度磷酸化和突触损伤加剧;此外，慢性胰岛素抵抗能够激活APP/PS1小鼠脑内AGEs/RAGE及其下游ERK/NFκB通路，介导炎症和细胞凋亡增加。在瘦素缺失所致的慢性高糖环境下，以上病理特征的恶化共同导致了APP/PS1小鼠记忆及认知功能加剧。本项目的实施对指导T2DM人群预防AD的发生和发展以及寻找AD防治的新靶点具有重要的理论意义。