罗非鱼湖病毒（Tilapia lake virus,TiLV）引起的罗非鱼湖病毒病（Tilapia lake virus disease,TiLVD）是对全球罗非鱼产业危害较为严重的一种病毒性疾病。疫苗免疫是防控TiLVD的重要措施,但病毒蛋白的功能还知之甚少,优势抗原并不明确。同时,传统疫苗使用过程中,缺乏高效的疫苗载体或佐剂,疫苗效果难以充分发挥。本研究通过基因工程技术和分子生物学方法,从TiLV基因组蛋白中筛选优势抗原表位,并对其免疫原性和免疫保护效果进行评价。在此基础上,构建乙酰化菊糖载疫苗系统,评价其免疫保护效果。结果如下:1.根据TiLV基因组信息（MK425010.1;MK425011.1;MK425012.1;MK425013.1）,采用原核表达技术分别制备表达Segment 1、Segment 2、Segment 3和Segment 4蛋白的原核表达菌株,经诱导表达和纯化获得4种重组蛋白,其大小分别为75 k Da,69 k Da,65 k Da,和56 k Da。结合酶联免疫吸附技术对4种重组蛋白进行抗原性分析,结果显示TiLV Segment 2编码的S2重组蛋白OD450值为0.64,显著高于其它重组蛋白,可以作为蛋白抗原用于后续疫苗制备。2.采用肌肉注射方式免疫奥尼罗非鱼（2±0.25 g）,免疫剂量分别为2mg/g、4mg/g和6mg/g S2重组蛋白。每周采集血清和组织样品,采用酶联免疫吸附试验、酶活性测定试验和荧光定量PCR评价其对罗非鱼的免疫激活效果。免疫35 d后,结合病毒攻毒试验评价其对罗非鱼的免疫保护效果。结果显示:与对照组相比,S2重组蛋白免疫组血清抗体效价水平、免疫相关生理指标和基因表达水平均显著提高（P＜0.05）。对照组死亡率为77.5%,2mg/g、4mg/g和6mg/g重组蛋白免疫组相对免疫保护率分别为29%、35.5%和45.2%。3.采用乙酰化方法对菊糖进行功能化修饰,结合双乳液溶剂蒸发法,对乙酰化菊糖（In Ac）和S2重组蛋白进行微球化处理,制备乙酰化菊糖微球载罗非鱼湖病毒疫苗系统（In Ac-S2）。通过核磁共振氢谱、傅里叶红外光谱、扫描电镜等方法对In Ac进行结构分析,采用扫描电镜、激光纳米粒度仪对In Ac-S2形貌结构、粒度和Zeta电位进行分析。结果表明:菊糖乙酰化修饰成功,为多孔结构的球形颗粒;In Ac-S2为饱满的球形颗粒状结构,平均粒度为649.33 nm,Zeta电位为-4.77 m V。4.采用肌肉注射方式免疫奥尼罗非鱼（2±0.2 g）,免疫剂量分别为1mg/g、2mg/g和4mg/g S2重组蛋白或In Ac-S2疫苗。每周采集血清和组织样品,采用酶联免疫吸附试验、酶活性测定试验和荧光定量PCR评价其对罗非鱼的免疫激活效果。免疫35 d后,结合病毒攻毒试验评价其对罗非鱼的免疫保护效果。通过异硫氰酸荧光素（FITC）对In Ac-S2疫苗系统进行荧光标记,并对疫苗系统在罗非鱼体内的分布情况进行探究。结果显示:与对照组和S2重组蛋白免疫组相比,In Ac-S2疫苗系统免疫组血清抗体效价水平、免疫相关生理指标和基因表达水平均显著提高（P＜0.05）。对照组死亡率为72.5%,In Ac-S2疫苗系统免疫组的最高保护率可达58.6%,比同剂量纯亚单位疫苗保护率提高近25%。In Ac-S2疫苗系统能显著增加抗原蛋白在罗非鱼肠道、肝、肾等组织中的含量。