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目的根据前期研究结果及文献复习,我们得出如下假设:1. CXCR4阳性牙髓细胞(CXC chemokine receptor4-positive dental pulp cells,CXCR4+DPCs)可能是牙髓在形成修复性牙本质过程中起重要作用的干/前体细胞;2.低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)可能是牙髓损伤后启动牙髓修复反应的重要启动因子;3.去铁胺(Deferoxamine, DFO)可能通过HIF-1α促进牙髓组织的修复能力。为验证上述假设,我们采用免疫磁珠筛选CXCR4+DPCs并进行鉴定,然后考察CXCR4+DPCs的细胞克隆形成能力及多向分化能力,从而证明CXCR4+DPCs具有干细胞的特性;采用DFO处理DPCs,观察其修复能力的变化,并结合RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,探讨DFO通过HIF-1α调节修复性牙本质形成的分子机理。材料和方法1.采用免疫磁珠筛选CXCR4+DPCs并进行鉴定,然后考察CXCR4+DPCs的细胞克隆形成能力及多向分化能力。2.不同浓度DFO作用DPCs不同时间后,从对细胞活性、增殖及迁移等几个方面的影响挑选出DFO的最佳作用浓度及时间。3.以腺病毒作为载体,构建HIF-1α shRNA,转染DPCs,干扰HIF-1α基因的表达并进行验证。4.体外观察DFO作用HIF-1α基因沉默前/后DPCs成牙本质分化能力的变化。5.观察DFO预处理HIF-1α基因沉默前/后DPCs在体内形成牙本质样组织的情况。结果1.成功分离和鉴定CXCR4+DPCs,证实其具有增殖能力强及多向分化能力特点。2.10μM DFO处理DPCs48h,可促进其增殖和横向迁移,并能提高其HIF-1α的表达,但是对其细胞活性和趋化作用的影响不明显。3. HIF-1α干扰腺病毒(pAd/pENTR/shRNA-/GFP-HIF-1α)在mRNA水平的干扰效率为73.4%,并在蛋白水平成功阻断了DFO促进DPCs HIF-1α的表达效果。4.10μM DFO处理DPCs48h,可以在体外促进其成牙本质分化。几个与成牙本质分化相关的基因也被上调。沉默HIF-1α基因后,DFO成牙本质分化的促进作用即被消除。5.体内实验结果显示10μM DFO预处理DPCs48h后,可在体内形成更多的牙本质样组织,沉默HIF-1α基因后,DPCs几乎不能形成牙本质样组织。结论1.本研究中我们成功分离CXCR4+DPCs,并证实其具有DPSCs的特性。2. DFO处理DPCs的最佳作用浓度为10M,最佳处理时间为48h。3.成功构建HIF-1α干扰腺病毒(pAd/pENTR/shRNA-/GFP-HIF-1α)。4. DFO可以在体外和体内促进DPCs成牙本质分化。沉默HIF-1α基因后,DFO的促进作用即被消除。