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目的:在体外试验系统,探讨六价铬(hexavalent chromi,um,Cr(Ⅵ))对L-02肝细胞钙稳态的影响及其可能机制。
方法:用L-02肝细胞为受试细胞,通过台盼蓝染色试验检测Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的影响,选取细胞存活率在75.0%以上的的3个Cr(Ⅵ)染毒浓度(即50rlmol/L、200gmol/L、8001xmol/L)作为后续试验染毒浓度,细胞染毒处理时间分别为:0、5、20、40、60、120分钟。细胞脂质过氧化损伤(MDA和GSH含量)、细胞膜通透性(LDH)、质膜与线粒体ATP酶分别用化学比色法检测;细胞膜流动性(荧光偏振度)与细胞内钙离子浓度([Ca<2+>]<,i>)用荧光比色法检测。
结果:Cr(Ⅵ)对L-02肝细胞存活率的影响:L-02肝细胞生存率随Cr(Ⅵ)处理浓度增加而降低。Cr(Ⅵ)处理浓度和L-02肝细胞生存率的相关系数γ=-0.993(P<0.01),两者呈负相关。
细胞内[Ca<2+>]<,i>变化:在50μmol/L组和200gmol/L组,随着染毒时间的延长,[Ca<2+>]<,i>呈升高趋势,其中200μmol/L组细胞内[Ca<2+>]<,i>浓度升高出现的最早时间为染毒40分钟,染毒120分钟时比对照组升高86.2%。在800μmol/L Cr(Ⅵ)组,细胞内[Ca<2+>]<,i>浓度升高出现的最早时间为染毒20分钟,染毒60分钟后则开始降低,120分钟时与对照组相比无显著差别。
细胞脂质过氧化损伤:随着Cr(Ⅵ)染毒浓度的增大和染毒时间的延长,细胞内MDA和GSH含量分别呈升高和降低趋势。其中,800gmol/L处理组:MDA和GSH含量最早出现明显改变,效应最早出现时间均为5分钟,在染毒120分钟时MDA含量较对照组增加242-3%,GSH含量减少65.9%。
膜通透性和流动性改变:随着Cr(Ⅵ)染毒浓度的增大和染毒时间的延长,LDH漏出和细胞膜荧光偏振度呈升高趋势,其中800μmol/L处理组LDH漏出与荧光偏振度最早出现明显改变,效应最早出现的时间分别为20、40分钟,在染毒120分钟时LDH漏出与荧光偏振度分别较对照组增加90.2%、18.9%。膜ATP酶活性变化:随着Cr(Ⅵ)染毒浓度的增大和染毒时间的延长,质膜Ca<2+>-ATP酶、Na<+>-K<+>-ATP酶、线粒体膜Ca<2+>-ATP酶活性呈降低趋势。其中,800μmol/L处理组3种ATP酶活性最早出现改变,效应最早出现时间为20分钟,染毒120分钟时3种ATP酶活性分别较对照组降低64.3%、62.2%、40.0%。
结论:Cr(Ⅵ)在50-800μmol/L水平可引起L-02细胞内钙稳态失调。Cr(Ⅵ)可通过损伤细胞膜(增加了细胞外钙离子的内流)与抑制ATP酶活性(减少细胞内钙离子向细胞外泵出及向线粒体转运)影响L-02肝细胞内钙离子浓度,而Cr(Ⅵ)诱导的氧化损伤则通过引起损伤细胞膜与抑制ATP酶活性,在L-02细胞内钙稳态失调中发挥作用。