一、背景和目的心肌梗死是导致死亡和失去健康生命调整年的主要原因之一。当前心肌梗死治疗的主要方式是通过溶栓和血管成形术迅速恢复梗死心脏的血液供应,这些均显著减少了心肌损伤及后续病人的死亡率。心肌梗死是由于冠状动脉血流中断引起的心肌细胞损伤和坏死的缺血性心脏疾病。在心梗发生后数小时内,细胞凋亡作为早期细胞死亡的主要方式开始启动,并向心室重构进展。同时,由于细胞坏死引起局部炎症反应,加剧了心脏功能恶化。如果不能及时进行血运重建,缺血区的心肌细胞就会被纤维组织替代,引起心室重构,并最终发展为心力衰竭。尽管急诊PCI技术再血管化及时挽救了部分心肌细胞,但是依然造成不同程度的心肌细胞坏死。目前每年仍然分别有10%和20%的死亡率和心梗后心力衰竭发生率。因此,寻找创新性的治疗方法来挽救更多的心肌细胞,抑制缺血区的炎症,促进缺血区的血管新生,阻止心室重构,改善心梗后病人的生存率是心肌梗死治疗的重要研究方向。细胞因子IL-19于2000年通过克隆测序被发现,证实其为IL-10同源物。IL-19与IL-10具有20%的氨基酸相似性,但在功能上与这些亚家族成员不同。IL-19通过IL-20Rα和IL-20Rβ组成的异二聚体受体发出信号,同时其受体也被IL-20和IL-24使用。与IL-10作用一样,IL-19作为抗炎细胞因子时通过Th2实现其效应而不是Th1。多项研究表明,在局部炎症或缺血的刺激作用下,多种细胞可表达IL-19并发挥其多种生物学效应。在外周血管,IL-19治疗可以增加结扎小鼠后肢的血流灌注。在脑血管,IL-19明显减轻瞬时大脑中动脉闭塞诱导的局灶性脑缺血的损伤。在心血管系统,IL-19可以通过调节巨噬细胞炎症和胆固醇稳态来阻止已形成的动脉粥样硬化斑块的进展。但IL-19对于急性心肌梗死的作用尚未有报道。本实验创新性建立无呼吸机辅助小鼠心梗模型,观察经腹腔注射IL-19对急性期缺血性损伤和心肌细胞凋亡的影响。观察连续腹腔注射IL-19对早期心脏功能、心肌炎症和血管新生的影响,探讨IL-19的治疗作用,并探索其潜在机制。二、实验方法1.小鼠心梗模型的制备采取无辅助呼吸的方法建立小鼠急性心肌梗死模型。过程如下:小鼠吸入异氟烷麻醉后,分离胸壁肌肉挤出心脏,结扎冠状动脉左前降支,建立心梗模型。心电图ST段抬高及心脏颜色变苍白,证实造模成功。假手术小鼠只开胸挤出心脏,不结扎冠状动脉。2.小鼠实验分组我们共进行过3批小鼠实验。具体如下:第一批小鼠用于检测IL-19在小鼠急性心梗后的表达研究,其中假手术组和冠状动脉左前降支结扎组各8只,于术后24小时,异氟烷麻醉后,眼眶取血,用于血液中IL-19的测定。开胸后剪取小鼠心脏左前壁梗死区,并分为两份,其中一部分进行蛋白免疫印迹检测,另一部分多聚甲醛固定行免疫组化分析。第二批小鼠用于IL-19在急性心梗的保护功能研究,于结扎即刻,腹腔注射PBS和IL-19（10 ng/g）,每组小鼠各15只,于术后24小时处死小鼠,用于后续功能分析。第三批小鼠用于IL-19在早期的心梗保护的功能研究,MI模型制作成功后,进行实验分组,其中假手术组、心梗+PBS注射组和心梗+IL-19注射组各20只。注射组小鼠在靶血管结扎即刻,经腹腔注射PBS或IL-19,并连续注射3天或7天后,处死小鼠,进行后续功能分析。3.Western Blot测心肌中的IL-19及其受体IL-20Rα与IL-20Rβ的表达第一批假手术小鼠和心梗小鼠各8只,在术后24小时,异氟烷麻醉,开胸剪取左心室前壁梗死心肌约0.2 g,液氮研磨,裂解于RIPA裂解液,4°C,15000g,离心3 min去除沉淀。蛋白上清经BCA法定量后,加入适量SDS蛋白上样缓冲液,混匀并置于沸水浴中变性10 min。变性蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后,电转到PVDF膜,TBST漂洗后,用5%脱脂奶粉中封闭1小时,适当稀释过的一抗,置于4℃孵育过夜,次日用TBST洗膜3次,每次10 min,随后加入稀释后的辣根过氧化物标记的二抗,室温孵育1小时,孵育结束后用TBST洗膜3次,每次10 min。洗膜结束后,将膜平放在水平塑料板上,将已配好的ECL化学发光液均匀的滴加在膜上,放入成像仪中,扫描成像。Western Blot图像通过Image J软件测量各条带的灰度值,获得计量资料结果,并进行统计分析。4.ELISA测定IL-19等的表达将抗体稀释至为1-10μg/ml,取0.1 ml加入聚苯乙烯板的反应孔中,4℃过夜。次日,弃溶液,用缓冲液洗涤3次,每次3 min。加稀释的待检样品0.1 ml于包被孔中,置37℃孵育60 min,洗涤,在各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体0.1 ml,37℃孵育40 min,洗涤后,于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1 ml,37℃20 min,反应孔中加入2 M 0.05ml H₂SO₄终止反应。在ELISA检测仪上,以ABTS于410 nm处显色,以空白对照孔调零后测各孔OD值,依据倍数大小判定结果。5.免疫组化和TUNEL染色小鼠按时间点,用麻醉加KCl注射法处死后,剪下心脏,于PBS缓冲液中反复冲洗后,固定于4%多聚甲醛,并进行石蜡包埋和切片,切片厚度为5μm。石蜡切片用二甲苯脱蜡后,梯度乙醇入处理,并用蛋白酶K消化修复抗原,0.01 M PBS缓冲液冲洗后,4℃下0.1%枸橼酸钠溶,进行微波修复,持续时间4 min。3%H₂O₂处理5 min,0.01 M PBS冲洗3次,每次5 min,室温下滴加50μl一抗或TUNEL反应液,孵育30 min;0.01 M PBS冲洗3次,每次5 min。50μl Converter POD,7度孵育30 min,0.01 M PBS清洗3次,每次3 min。DAB显色,室温孵育15 min,冲洗后,苏木精复染,烤干,封片,摄像。6.EVANS Blue/TTC双染测定心肌梗死面积小鼠气管插管后,连接呼吸机,诱导麻醉。沿心梗模型制备时的位置剪开胸腔,暴露心脏。通过1 ml注射器,经右心房-右心室途径穿刺缓慢注入2%伊文思蓝（Evans Blue）0.8 ml左右,观察2 min,待小鼠四肢及巩膜蓝染后迅速取下心脏,以预冷的PBS缓冲液反复冲洗残留血液至清洗溶液不再染色。置于-20°冰箱中冷冻30 min。取出后沿左心室长轴方向横切5片,单片厚约1 mm。按先后顺序将切片置于2%TTC溶液中,浸泡于避光的37℃恒温箱中,轻摇动使溶液与切片充分接触20 min后,立即冲洗掉多余的染料。使用扫描仪行正反两面扫描,并通过Image J软件测量各部分的面积,进行统计分析。7.原代心肌细胞分离培养及缺氧模型构建新生1天C57BL/6J乳鼠经75%酒精消毒后,剪开胸腔,暴露并剪取心脏,置于Hank’s溶液中,弃去心房、主动脉、肺动脉以及下腔静脉脂肪等多余组织,将心室组织剪成大小1立方毫米左右的组织块,并经多次漂洗。加入已配置好的胶原酶消化液（终浓度为1 mg/ml）,置于37°C恒温水浴中振荡消化1小时。加入等量的含10%胎牛血清的M-199培养基,中和消化液,用100目滤网过滤消化液,1000g离心10 min,弃去上清液,细胞沉淀用含5%胎牛血清的M-199培养基重悬。重悬后的细胞种植于培养瓶中,进行40 min非心肌细胞贴壁,收集未贴壁的心肌细胞,按1×10⁶个/ml,铺于培养板中,培养2天,可观察到心肌细胞的自发搏动。待心肌细胞状态稳定后,换不含血清的DMEM培养基,再加入外源性药物处理;处理完后将乳鼠心肌细胞培养基,换成不含葡萄糖以及血清的DMEM培养基,并转移到含有95%氮气以及5%二氧化碳的无氧培养箱中培养8小时,随后检测细胞相关生物学指标的改变。8.MTT法检测心肌细胞的活性使用碧云天MTT试剂盒检测心肌细胞及IL-19处理后心肌细胞的活性。将25毫克3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）粉末配成浓度为5 mg/ml的MTT工作液。将心肌细胞按2×10³-5×10³的密度铺于96孔细胞培养板中,置于培养箱中培养。待细胞贴壁后,换100μl培养基,再进行低氧培养及IL-19处理前,加入10μl MTT溶液,在570 nm波长下测定吸光度,读取处理0小时吸光度,随后在培养箱中继续培养4小时,再每孔加入100μl甲瓒溶解液,待4小时甲瓒完全溶解后在570 nm波长下测定吸光度,收集读取吸光度,并作统计分析。9.流式细胞术检测心肌细胞凋亡心肌细胞经低氧及IL-19处理8小时后,收集培养上清至15 ml离心管中,备用;用PBS洗涤已吸净培养基的心肌细胞,加入胰酶消化液消化贴壁的心肌细胞,待细胞变圆透亮时,弃去胰酶,加入适量的完全培养基,并用吸管缓慢轻柔的吹打细胞,将吹打下来的细胞转移至上述收集上清的15 ml离心管中,1000g离心5 min,弃去上清液,再加入适量PBS重悬离心沉淀的细胞,并计数。将约5-10×10⁴个细胞转移至细胞流式细胞管中,1000 g离心5 min,弃去上清液,再加入195μl的Annexin V-FITC的结合液,并用移液枪吹打混匀细胞;细胞混匀后按以下方法加入5μl Annexin V-FITC及10μl碘化丙啶染色液（PI）,轻轻吹打混匀细胞,在室温下避光孵育10-20 min,孵育结束后使用流式细胞仪检测。10.RNA抽提及实时荧光定量PCR左心室梗死区组织放入1.5 ml无RNA酶离心管中,并加入1 ml Trizol,用匀浆器匀浆组织,离心取上清,加入200μl氯仿,上下颠倒混匀30 s,室温放置10 min。将混合液体4℃、12000g离心20 min,小心的将上层液体转移到新的离心管中,并加入等体积的异丙醇,颠倒混匀并静置10 min。将液体4℃、12000 g离心20 min,弃去上清,加入800μl 75%乙醇,轻轻的振荡洗涤沉淀,4℃、10000 g离心5 min。弃去上清,晾干残余水分,加入20μl DEPC水溶解RNA,测量RNA浓度。使用TAKARA的PrimeScript?RT Master Mix的试剂盒将RNA合成cDNA。将已反转录得到的cDNA稀释10倍后,用做荧光定量PCR反应的模版,采用SYBR法进行PCR荧光定量,反应结束后,收集数据,根据Ct值,以GAPDH为内参,用2^-ΔΔCt计算各个基因的相对表达。11.超声心动图测定小鼠心功能小鼠连接异氟烷麻醉系统,以2%异氟烷诱导麻醉。脱毛膏脱去前胸左侧毛发。以口鼻接入麻醉面罩,以VISUAL SONICS 2000小动物超声系统于胸骨左旁检查左室射血分数（LVEF）及左室短轴缩短率（FS）,单只小鼠同一体位检测3次,取平均值。12.统计学分析实验中的计量资料以平均值±标准差计算。实验中两组独立样本,进行t检验;多组样本间,先行单因素方差分析（one-way ANOVA）,再行两两比较。以P<0.05作为显著性差异标准。使用Kaplan-Meier生存曲线计算存活率,各组之间的差异采用log-rank（Mantel-Cox）评估。统计学分析使用GraphPad Prism 5.0版本进行。三、实验结果1.IL-19及其受体IL-20Rα与IL-20Rβ在急性梗死心肌中的表达通过冠状动脉左前降支结扎构建小鼠心梗模型。心电图显示ST段抬高,左心室前壁及心尖部变白,表明小鼠急性心梗模型建立成功。术后24小时,心梗组及假手术组各有8只小鼠存活。眼眶取血后,ELISA测定小鼠血清中IL-19的水平,结果显示心梗小鼠血清中IL-19显著降低约50%（P<0.05,n=8）。小鼠开胸后,剪取心肌梗死区,一部分用于免疫组化,另一部分用于蛋白提取。Western Blot结果显示,假手术组小鼠的心肌中仅见少量IL-19表达,但在心梗组,IL-19在梗死心肌的表达水平显著增加,同样IL-19的受体IL-20Rα和IL-20Rβ蛋白在梗死心肌中的表达水平,也明显高于假手术小鼠（P<0.05,n=3）。心脏切片行免疫组织化学分析,显示IL-19在心梗组明显高于假手术组,且IL-19表达主要集中在血管周围和炎症细胞浸润部位（P<0.05,n=3）。2.IL-19在急性心肌梗死中对心肌细胞的保护作用（1）IL-19治疗明显降低缺氧诱发心肌梗死面积,减轻心肌缺氧诱发的心肌细胞凋亡,减轻梗死区心肌细胞的氧化损伤。在心梗模型制作成功后,30只随机分为PBS注射组和IL-19注射组,每组各15只。其中7只小鼠,于PBS或IL-19注射24小时后,进行处死,并行Evans Blue/TTC双染,评价心肌梗死面积。Evans Blue着色蓝色区域为正常区,TTC染色为红色的部分是缺血心肌组织,苍白色部位为梗死区。通过EPSON1610扫描仪正反两面拍照后,用Image J软件测量各区域面积,并计算梗死区/缺血区的比率。结果显示,与PBS对照相比,IL-19治疗组明显减轻了梗死面积（P<0.05,n=7）。每组小鼠各7只取梗死区心肌,固定在多聚甲醛,通过TUNEL染色检测心肌细胞的凋亡情况。每只小鼠随机观察5个视野,计算凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比,取平均值作为该小鼠的凋亡指标。结果显示IL-19治疗减少了小鼠心肌细胞的凋亡（P<0.05,n=7）。取小鼠心梗区,抽提蛋白,定量后,检测小鼠心肌中血红素加氧酶-1（HO-1）和丙二醛（MDA）水平,结果显示IL-19治疗进一步增强了HO-1活性,并降低了小鼠梗死心肌中的MDA水平（P<0.05,n=7）。（2）IL-19预处理剂量依赖性增加原代乳鼠心肌细胞的活力,减轻缺氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡培养新生小鼠心肌细胞,用IL-19（0,1,10,100ng/ml）预处理2小时,然后将其中一部分细胞暴露于缺氧环境中刺激8小时后。通过MTT检测各组心肌细胞的活力,结果显示在正常培养的心肌细胞中IL-19没有提高心肌细胞的活力,但在缺氧刺激的心肌细胞中,IL-19预处理能够抑制缺氧损伤导致的心肌细胞活力下降,并且具有剂量依赖效应。通过Anexin V/PI染色,并通过流式细胞术检测心肌细胞的凋亡,结果显示IL-19预处理呈剂量依赖性抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡（P<0.05,n=5）。检测乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）释放,检测HO-1的表达和活性。结果显示IL-19呈剂量依赖性减少乳酸脱氢酶和丙二醛在缺氧条件下的释放（P<0.05,n=5）。定量PCR显示,IL-19呈剂量依赖性增加HO-1的表达和活性（P<0.05,n=5）。3.长时程IL-19干预在心肌梗死早期中的功能研究（1）长时程IL-19干预改善心梗小鼠的心脏功能在心梗模型制作成功后,我们将心梗小鼠随机分为PBS注射组和IL-19注射组,每组小鼠各7只,并进行相应试剂腹腔注射。7天后,我们通过超声心动图,评估小鼠的心脏功能,结果显示:LAD结扎7天后,IL-19治疗组心梗小鼠的左室射血分数和短轴缩短率明显高于PBS注射组（P<0.05,n=7）。（2）长时程IL-19干预减轻心肌梗死区域的炎症反应在心梗模型制作成功后,我们将心梗小鼠随机分为PBS注射组和IL-19注射组,每组小鼠各7只,相应试剂连续注射3天后,处死小鼠,免疫荧光测定心肌中CD68阳性细胞数。结果显示,与假手术组相比,梗死心肌中CD68阳性细胞数目明显增加,而IL-19腹腔注射能够明显减少心肌梗死区域CD68阳性细胞数目（P<0.05,n=3）。通过检测中性粒细胞的功能标志和激活标志（髓过氧化物酶）,表明IL-19处理能够明显降低髓过氧化物酶的活性（P<0.05,n=7）。通过ELISA检测外周血中炎症因子的水平,结果显示TNF-α水平,IL-1β和IL-6水平在心梗组明显高于对照组,而IL-19处理能明显抑制TNF-α水平,IL-1β和IL-6在心梗鼠的升高（P<0.05,n=7）。（3）IL-19促进巨噬细胞由M1向M2转化为测试心肌梗死心脏中的巨噬细胞亚群分布特点,我们在心梗后3天,通过酶消化法将心肌组织制成单细胞悬液,并通过流式细胞术分析心脏细胞成分,结果显示心梗后心脏中鉴定出两个巨噬细胞亚群:通过F4/80和CD86的双重染色标志M1巨噬细胞,以F4/80和CD206的双重染色标志M2巨噬细胞。IL-19处理使M1巨噬细胞的百分比降低了约9.1%（P<0.05,n=7）,并使M2巨噬细胞的百分比增加了约9.5%（P<0.05,n=7）。通过定量PCR检测显示,心肌梗死能够明显增加CD68、TNF-α、IL-1β和IL-6在心肌中的表达水平,而IL-19处理能够明显抑制梗死诱发的CD68、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达增加（P<0.05,n=7）。相反,通过定量PCR检测,显示IL-19处理能够明显增强了CD206,Arg1和Ym1的mRNA表达,并下调了IFN-γ的mRNA表达（P<0.05,n=7）。（4）IL-19促进梗死区域VEGF的表达和血管新生连续腹腔注射7天后,取梗死心肌,通过CD31免疫组化染色观察心肌血管生成。结果显示,在所检测的7只小鼠的切片中,用IL-19干预能够明显心肌梗死区域微血管密度（P<0.05,n=7）。通过ELISA检测心肌的血管内皮生长因子（VEGF）蛋白水平,显示心梗后7天心肌中IL-19处理的心梗小鼠心脏中的VEGF的蛋白水平明显高于MI组（P<0.05,n=7）。（5）IL-19提高心梗小鼠的存活率我们进一步评估了IL-19连续腹腔注射7天对心梗后小鼠存活的影响。结果显示,与心梗小鼠相比,IL-19干预组的心梗小鼠的存活率明显提高（P<0.05,n=9）。四、结论1.IL-19在急性心梗组织中的表达明显升高,主要富集在血管周围和炎症区域。2.IL-19腹腔注射能够减轻了心梗诱发的急性心肌损伤,能够明显抑制缺血诱发的心肌细胞凋亡。3.IL-19持续注射能够改善心梗早期的心功能,能够减轻心肌的炎症反应,能够促进巨噬细胞的由M1向M2转化,能够促进VEGF在心肌中的表达及其介导的血管新生;能够提高小鼠的存活率。4.我们的结果提出IL-19可能是一种有潜力的抗缺血性心脏病的治疗选择。