论文部分内容阅读
本研究采用高能脉冲紫外诱变的方法对银耳芽孢进行诱变,这是一种新型的食用菌诱变方法。肌醇-1-磷酸合成酶基因是肌醇合成的关键酶基因,我们利用分子生物学方法从野生型银耳菌株中克隆了肌醇-1-磷酸合成酶基因,并进行了原核表达。同时,构建了EGFP基因银耳表达载体pCB-BEGFP,在电激转化法介导下,将EGFP基因导入银耳,并对转化子进行了检测。最后,利用pCB-BEGFP载体,构建了肌醇-1-磷酸合成酶基因银耳表达载体,在电激转化法介导下,将肌醇-1-磷酸合成酶基因转入银耳肌醇缺陷型菌株。具体结果如下:1银耳芽孢的高能脉冲紫外诱变对比高能脉冲紫外诱变与传统紫外诱变的诱变效应,传统紫外诱变获得了70个缺陷型菌株,经传代后都被修复,没有获得稳定的突变体,高能脉冲紫外诱变后有90个缺陷型菌株,经过传代后获得1株稳定的缺陷型突变体,经鉴定是肌醇、吡哆醇缺陷型。突变体Au813的生长迟缓期比野生型多4天,生长速度较慢。2银耳肌醇-1-磷酸合成酶基因的克隆表达通过TAIL-PCR、3’-RACE等分子生物学方法测定了银耳肌醇-1-磷酸合成酶基因(MIPS)的cDNA全序列,设计引物,以野生型银耳总RNA为模板,逆转录PCR克隆了MIPS基因的cDNA,开放读码框为1695 bp,编码564个氨基酸。将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET29a(+)原核表达载体上,构建原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE结果表明:银耳MIPS基因获得了表达,其表达量随着时间的延长而有所增加。3 EGFP基因银耳表达载体的构建与表达以质粒pCAMBIA1300和pEGFP为出发质粒,把pEGFP用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,回收带有双孢蘑菇GPD启动子、Tnos终止子及EGFP基因的片段,置换插入pCAMBIA1300的多克隆位点,获得重组质粒pCB-BEGFP,利用电激介导转化法,把携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP导入银耳中,获得了大量的转化子。通过对转化子的PCR检测(包括EGFP基因、Tnos终止子),证实了EGFP基因已整合到转化子基因组DNA中。转化子用蓝光激发,在荧光显微镜下发绿光,表明EGFP基因在银耳中得到表达。4肌醇-1-磷酸合成酶基因转化银耳AU811菌株以质粒pCB-BEGFP为出发质粒,以MIPS基因置换质粒pCB-BEGFP上的EGFP基因,获得重组质粒pCB-MIPS,利用电激介导转化法,把携带MIPS基因的银耳表达载体pCB-MIPS导入银耳肌醇缺陷型菌株中,获得了大量的转化子。通过对转化子的PCR检测(包括355启动子hpt基因和Tnos终止子),证明了MIPS基因已整合到转化子基因组DNA中。验证转化子在基本培养基上的生长情况,结果表明肌醇缺陷型菌株没有恢复为野生型。