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研究背景: 肺癌的发生率与死亡率均占恶性肿瘤首位,其中80~85％为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。目前以手术、放疗、化疗和靶向治疗为主的肺癌综合治疗疗效仍然欠佳,进一步提高NSCLC疗效是当前肿瘤学领域亟待解决的问题。氧化应激与肿瘤进展关系密切,研究表明脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶( apurinic/apyrimidinic endonuclease, Ape1/Ref-1)和wtp53作为众多的氧化应激因子之一具有突出作用。Ape1/Ref-1是一种独特的DNA损伤修复、氧化还原和参与RNA代谢的多功能蛋白,除了与肿瘤发生发展有关外,它还涉及氧化应激、细胞周期调控及凋亡等多种关键细胞功能,其表达升高能明显增加 NSCLC的放射敏感性从而促进细胞凋亡。抑癌基因p53作为“基因卫士”能编码序列特异性转录因子,从而诱导细胞逃逸和凋亡,维持细胞周期完整、DNA损伤修复和基因的稳定性。三羟异黄酮(genistein, GEN)是大豆中的主要异黄酮成分,研究报道其能有效降低氧化应激诱导的Ape1/Ref-1蛋白表达却上调野生型p53蛋白表达。目前研究发现野生型p53作为Ape1/Ref-1的转录负调节因子,可以抑制Ape1/Ref-1蛋白的表达,而Ape1/Ref-1可通过氧化还原依赖和氧化还原非依赖两条途径调节p53蛋白的DNA结合活性,从而促进下游p21,BAX,Bcl-2等凋亡基因的转录激活。故Ape1/Ref-1和p53交互作用可能是三羟异黄酮介导非小细胞肺癌放疗增敏的重要核心事件。然而,Ape1/Ref-1和p53不仅具有相互调控作用,在肺腺癌和宫颈癌细胞中还存在内源性和外源性结合作用,故研究并阐明二者的结合情况及其机制以及三羟异黄酮介导Ape1/Ref-1和p53相互调控作用对A549细胞放疗的影响及机制,对以Ape1/Ref-1为靶分子的三羟异黄酮增敏肺癌放射治疗研究,探讨与肿瘤放化疗抵抗之间的关系进一步提供实验基础。 研究目的: 1.研究三羟异黄酮(genistein, GEN)下调肺腺癌 A549细胞 Ape1/ Ref-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease1/redox factor-1)、上调p53表达以及三羟异黄酮对A549细胞增殖凋亡的作用,探讨三羟异黄酮调节Ape1/Ref-1和p53交互作用对肺癌放疗的影响及机制,为以Ape1/Ref-1为靶分子的三羟异黄酮增敏肺癌放射治疗转化研究提供实验基础。 2.研究Ape1/Ref-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease1/redox factor-1)和p53蛋白相互结合及结合的分子机制,从而进一步探讨相互间转录调控与肿瘤放化疗抵抗的关系并奠定实验基础。 研究方法: 1.三羟异黄酮(genistein,GEN)单独及联合放疗对A549细胞增殖凋亡的影响观察:细胞存活实验检测不同浓度三羟异黄酮单独作用 A549细胞不同时间,细胞的生长抑制情况;锥虫蓝染色计数三羟异黄酮和放疗联合或不联合处理 A549细胞后第2-6天的存活数量。 2.三羟异黄酮调节 Ape1/Ref-1和p53蛋白表达对三羟异黄酮单独及联合放疗促进A549细胞照射后凋亡的影响观察:Western blot检测不同浓度三羟异黄酮单独作用A549细胞不同时间,三羟异黄酮单独及联合放疗作用 A549细胞后, Ape1/Ref-1蛋白和p53蛋白的表达。 3.Ape1/Ref-1和p53的相互调控作用:共转染Ape1/Ref-1启动子荧光报告基因载体和不同量WTp53表达质粒于A549细胞,Western blot实验检测细胞内Ape1/Ref-1表达,双荧光素酶报告基因实验检测野生型p53对Ape1/Ref-1启动子区转录活性的调节;EMSA实验观察p53蛋白的DNA结合活性在三羟异黄酮的作用下的变化。 4.Ape1/Ref-1和p53内源性和外源性结合作用的研究探讨:免疫共沉淀和GST-pull down沉降试验观察Ape1/Ref-1蛋白和p53蛋白的内源性和外源性结合情况,同时免疫荧光观察过氧化氢处理或不处理条件下,细胞中Ape1/Ref-1和p53蛋白的亚细胞共定位情况。 研究结果: 1.三羟异黄酮(genistein,GEN)单独及联合放疗对 A549细胞增殖凋亡的观察:细胞生存实验(MTT)结果显示三羟异黄酮单独及联合放疗对 A549细胞增殖抑制率呈剂量和时间依赖性,即三羟异黄酮抑制放疗照射后 A549细胞的增殖存活,且浓度越高,作用时间越长,增殖抑制率越高;锥虫蓝染色细胞计数实验分别计数对照组,单纯药物组,单纯照射组,药物联合照射组,A549细胞第2-6天的存活细胞数显示三羟异黄酮联合放疗明显抑制A549细胞生长。 2.三羟异黄酮调节 Ape1/Ref-1和p53蛋白表达对三羟异黄酮单独及联合放疗促进A549细胞照射后凋亡的影响观察:三羟异黄酮下调细胞内Ape1/Ref-1蛋白,上调p53蛋白具有浓度和时间依赖性,即随着三羟异黄酮作用浓度递增,作用时间延长, Ape1/Ref-1蛋白表达逐渐减弱,p53蛋白表达逐渐增加。放疗照射细胞后诱导细胞内Ape1/Ref-1和p53蛋白表达上调,三羟异黄酮下调放疗诱导的Ape1/Ref-1蛋白表达,却协同促进照射后胞内p53蛋白的诱导表达。 3.Ape1/Ref-1和p53相互调控作用的研究探讨:共转染Ape1/Ref-1启动子荧光报告基因载体(-184/+65APE1-Luc)和不同量野生型p53(WTp53)过表达质粒于A549细胞,随WTp53质粒转染量的递增,胞内Ape1/Ref-1蛋白表达逐渐降低。且野生型p53对Ape1/Ref-1启动子区转录活性的抑制作用随p53表达质粒转染量的递增逐渐增强,故 WTp53可能通过抑制 Ape1/Ref-1启动子区的转录活性从而下调 A549细胞内Ape1/Ref-1蛋白的表达水平。EMSA结果显示三羟异黄酮提高A549细胞p53蛋白的DNA结合活性,进而刺激下游基因的表达。 4.Ape1/Ref-1和 p53内源性和外源性结合情况的研究:免疫共沉淀实验证实Ape1/Ref-1和p53两蛋白存在内源性结合,GST-pull down沉降试验证实二者存在外源性结合作用。免疫荧光实验观察过氧化氢(TBHP)在处理或不处理条件下,Ape1/Ref-1和p53蛋白的形态学共定位,结果显示其亚细胞定位为核浆共定位,但主要分布在胞核,少量在胞浆。 结论: 1.三羟异黄酮抑制肺腺癌A549细胞生长,对放疗诱导的细胞凋亡有协同作用;三羟异黄酮下调Ape1/Ref-1蛋白表达上调p53蛋白表达具有时间和浓度依赖性,其联合放疗可以抑制照射诱导的 Ape1/Ref-1蛋白表达增高,进一步促进放疗照射诱导的p53蛋白表达。野生型 p53可能通过抑制 Ape1/Ref-1启动子区的转录活性从而下调A549细胞内Ape1/Ref-1蛋白的表达水平。三羟异黄酮促进p53蛋白的DNA结合活性。为探讨三羟异黄酮调节Ape1/Ref-1和p53交互作用对肺癌放疗的影响及机制,进行以Ape1/Ref-1为靶分子的三羟异黄酮增敏肺癌放射治疗转化研究提供实验基础。 2.Ape1/Ref-1蛋白和p53蛋白在肿瘤细胞中存在内源性和外源性的结合作用,从而进一步探讨相互间转录调控与肿瘤放化疗抵抗的关系并奠定实验基础。