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研究背景：组织因子(tissue factor,TF)是生理性凝血级联反应的始动者之一。不仅广泛分布于血液循环系统,近年来发现还存在于肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞系统中,在前列腺癌等实体肿瘤中更为明显。且TF的表达与活化和多种恶性肿瘤的生长、侵袭转移及血管新生密切相关。凝血因子Ⅶ(FⅦ)是TF最常见的配体,具有与TF较强的亲和力及识别特性,我们可利用这些特性将目的片段通过FⅦ携带到高表达TF的肿瘤局部而产生高效的生物效应。目的：扩增人FⅦ基因片段及IgG1Fc基因片段,并构建融合基因的pGC-FU线性载体；将包含融合基因mFⅦ/Fc线性载体包装为慢病毒载体；包装的慢病毒载体(Lenti-mFⅦ/Fc):转染人骨髓间充质干细胞(hMSCs),获取融合基因稳定表达载体,为前列腺癌的基因治疗奠定基础。方法：体外克隆人凝血因子Ⅶ(FⅦ),点突变技术在基因水平将341部位Lys突变为Ala后,与免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因融合,构建融合基因mFⅦ/Fc线性pGC-FU质粒载体。经鉴定阳性克隆后,送公司进行序列测定。将成功构建的pGC-FU载体转染293T细胞包装为Lenti-mFⅦ/Fc,通过观察GFP荧光蛋白表达情况并进行Western bolt检测,确定包装成功。采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, RTq-PCR)检测慢病毒的滴度。分别以不同的感染复数(Multiplicity of infection, MOI值)将Lenti-mFⅦ/Fc及空载GFP的慢病毒(Lenti-GFP)转染第三代hMSCs,荧光共聚焦显微镜下观察其表达情况,并确定最佳MOI值。以最佳MOI值将Lenti-mFW/Fc转入hMSCs,分别在转染后的24h、48h、72h、96h、120h收集上清液行酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA),并在转染效率较高时收集细胞行RT-PCR检测,分别从蛋白水平及mRNA水平检测mFⅦ/Fc融合基因的表达情况。结果：1、全骨髓法分离培养的hMSCs,生长态势良好,48小时后贴壁生长,细胞呈团簇集落生长,随着不断传代,细胞纯度升高；取第三代细胞进行流式细胞术检测,显示CD29+(98.08%)、CD44+(97.63%)、CD34+(0.31%)、CD45+(0.58%),符合MSCs特征。2、所构建融合基因经基因测序及PCR检测与GenBank ID:AF272774对比,(除同义变异)完全相符；包装后的重组慢病毒载体经RTq-PCR检测滴度为2×108TU/ml;转染第三代hMSCs后,得出MOI=50为最佳值。3、慢病毒转染后共聚焦荧光显微镜观察,转染24小时后未见明显荧光表达,随着时间变化,荧光表达逐渐增强；转染72小时后荧光表达最强,经ELISA及RT-PCR证实转染mFⅦ/Fc基因的hMSCs有蛋白水平的表达和mRNA的转录。结论：通过定点突变技术与基因融合技术可成功构建碱基对为2000左右的mFⅦ/Fc线性pGC-FU融合基因载体；线性pGC-FU融合基因载体转染293T细胞,经鉴定可成功包装为慢病毒表达载体；使用慢病毒载体将融合基因转入hMSCs不仅具有较高的转染效率,还可获得稳定表达的真核细胞表达载体。