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猪流行性腹泻病毒（PEDV）是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一,并在世界各地广泛流行,严重威胁着养猪业的健康发展。根据遗传演化分析结果,可将PEDV分为G1型和G2型。目前现地流行毒株大部分属于G2型,经典疫苗毒株CV777属于G1型,尽管经典的PEDV弱毒疫苗和灭活苗对PEDV的防控起到了一定作用,但是不能完全有效地控制PEDV的流行。因此,筛选新型的PEDV疫苗候选毒株迫在眉睫。本实验室于2014年分离到1株PEDV流行毒株LNCT2株,通过全基因组演化分析表明,该分离毒株与目前国内的流行毒株亲缘关系较近,属于G2型PEDV毒株。通过噬斑纯化的方法获得抗原性单一的克隆毒株,利用血清中和试验测定不同克隆毒株的抗体滴度,筛选到了具有良好免疫原性的克隆毒株。采用体外连续传代的方法致弱病毒,并分析不同代次基因组的特征。为了验证低温传代对PEDV遗传演化的影响,采取了常温传代（NA）和低温传代（CA）两种方法进行病毒的致弱,利用生物信息学软件对两种传代方式的毒株进行全基因组的序列分析。结果表明,与常温传代毒株相比,低温传代可以促进PEDV的变异。对不同代次的LNCT2毒株全基因组进行克隆测序,分析比较其基因序列差异,结果表明LNCT2毒株在传代过程中氨基酸的突变率随着体外传代代次的增加而增加。为研究温度对病毒生物学特性的影响,本研究通过测定两种传代温度下病毒的滴度,发现病毒滴度随着代次的增加而升高,30代以后病毒滴度升高更快,两个克隆株病毒滴度在第100代时均达到了106 TCID50/mL以上,表明温度对病毒滴度影响不大。此外,为了解LNCT2株与经典毒株CV777致弱过程中的差异,分析比较LNCT2株第100代（LNCT2-P100）与LNCT2第5代（LNCT2-P5）之间基因组的变异特征,结果显示,LNCT2株S蛋白和复制酶ORF1ab的氨基酸突变数量最多,且S蛋白出现了5个连续的氨基酸缺失,第100代未出现ORF3的缺失现象;而经典毒株CV777的S蛋白和复制酶ORF1ab氨基酸突变率明显比LNCT2高很多,表明两者在体外传代致弱过程中氨基酸的突变率存在显著差异。比较分析不同代次LNCT2-NA与LNCT2-CA的氨基酸序列,发现N蛋白均没有发生突变,而M蛋白虽然出现突变,但突变位点和突变后的氨基酸种类相同,说明PEDV N蛋白与病毒适应Vero E6细胞无关,且M蛋白对低温不敏感。为验证LNCT2-P100的毒力是否已经减弱,本研究选择常温传代的LNCT2-P100和LNCT2-P10株对1日龄的健康仔猪进行感染试验,攻毒剂量为2×104 TCID50/头,试验结果显示,P10攻毒组仔猪均出现剧烈的呕吐和腹泻等临床症状,P100攻毒组仔猪未出现异常表现。剖检各组仔猪发现P10组仔猪小肠内充满黄色液体,肠壁明显变薄。组织病理学检测结果显示,P10攻毒组仔猪小肠绒毛脱落萎缩,IHC结果显示,P10攻毒组病毒主要分布在小肠绒毛的表面,P100和空白对照组仔猪均未检测到病毒。利用RT-q PCR的方法测定各组仔猪肠道内病毒的载量,结果显示P10组仔猪小肠各段均能检测到病毒的核酸,P100组和空白对照组仔猪小肠绒毛完整且没有检测到病毒的核酸。总之,本研究通过噬斑克隆、血清抗体中和试验筛选到一株疫苗候选株。通过分析LNCT2毒株在体外传代过程中全基因组的遗传演化特征,发现基因的突变频率随着病毒体外传代次数的增加而增加。不同代次LNCT2-NA与LNCT2-CA的氨基酸序列分析结果显示PEDV N蛋白与病毒适应Vero E6细胞无关,且M蛋白对低温不敏感。动物试验结果表明LNCT2-P100口服接种仔猪后没有出现临床症状。基因组测序结果显示LNCT2致弱后ORF3基因没有出现缺失突变,揭示了PEDV的致弱可通过多种分子机制实现;低温传代可以促进PEDV基因组的变异。以上研究结果为研发新型高效的PEDV弱毒疫苗和了解PEDV毒力差异的分子机制奠定了基础。