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目的：蛙皮素(Bombesin),是一种脑肠肽,由14个氨基酸残基组成,对饮食和行为具有调节作用。在哺乳动物中,它的同类物有胃泌素释放激素(gastrin-releasingpeptide,GRP)和神经介素B(neuromedin B,NMB)。作为一种脑肠肽,蛙皮素对神经系统肿瘤、缺血及学习记忆都具有良性作用。有研究表明在帕金森病人脑内蛙皮素浓度增加,具有内源性抗癫痫作用。此外还有很多实验表明蛙皮素具有神经保护作用。下丘脑弓形核(arcuate nucleus,ARC),是成年哺乳动物体内能量平衡调节的重要区域。弓形核内的神经肽Y(neuropipte Y,NPY)神经元具有增加饮食的作用。本文使用NPY-GFP转基因小鼠,研究蛙皮素对于下丘脑弓形核内NPY神经元的作用及其可能机制。另外,还探索了蛀皮素对于脑缺血引起的大鼠学习记忆障碍的作用及其对于大鼠海马CA1区神经元离子通道的作用,从而进一步提供了蛙皮素神经保护作用的证据。
方法：第一部分:选取NPY-GFP转基因小鼠,NPY神经元中绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的表达由免疫组织化学和单细胞逆转录PCR(single-cellreverse transcription-PCR)确认。运用全细胞膜片钳技术,研究小鼠下丘脑脑片NPY神经元的电生理特性。首先观察蛙皮素对NPY神经元兴奋性的影响,然后观察蛙皮素对于NPY神经元串联电阻,反转电位的作用,最后在不同内外液条件下观察蛙皮素对NPY神经元的作用,来阐明蛙皮素对NPY神经元的作用机制。除此之外,我们还使用了蛙皮素家族的肽类(NMB和GRP)以及其他与饮食有关的肽类,比较了不同肽类对NPY神经元的作用。最后,还观察了蛀皮素对阿黑皮原(proopiomelanocortin,POMC)神经元的作用,与其对NPY神经元的作用进行比较。第二部分:选取18只成年Wistar大鼠,随机分成正常组、缺血组和缺血后蛙皮素干预组。用双侧颈总动脉结扎的方法制作大鼠全脑缺血模型,使用Morris水迷宫和长时程增强(long-term potentiation,LTP)记录的方式来研究蛙皮素对缺血引起的学习记忆障碍的作用。然后使用幼年Wistar大鼠,制作海马脑片,用膜片钳中的电压钳技术研究蛙皮素对钠离子通道的作用。所有实验数据经Student f检验或ANOVA等统计学处理,P<0.05表示存在显著性差异。
结果：⑴从弓形核中收获单个GFP阳性神经元后,运用单细胞RT-PCR技术观察GFP阳性神经元中含有NPY编码的mRNA,从而证明NPY-GFP转基因小鼠系建立成功。⑵蛙皮素(25011M)使NPY神经元动作电位频率增加了61.5±14.2％(n=15,P<0.05),使神经元的膜电位去极化5.0±0.5 mV(n=15,P<0.05)。⑶NMB(250nM)使NPY神经元动作电位频率增加66.5±10.6％(n=16,P<0.05),使神经元的膜电位去极化5.6±0.4 mV(n=16,P<0.05)。GRP(250nM)使NPY神经元动作电位频率增加9.2±10.5％(n=13,P>0.05),使神经元的膜电位去极化2.6±0.7 mV(n=13,P<0.05)。⑷蛙皮素使NPY神经元的输入电阻减少22.4±5.7％(n=8,P<0.05)。内向电流显示其反转电位在-18.3±3.4 mV。⑸电极内液中加入BAPTA(10 mM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神经元膜电位去极化作用减少到2.0 mV±0.6 mV(n=5,P<0.05)。使用无钙细胞外液时,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神经元膜电位去极化作用增加到9.0±1.4 m3/(n=5,P<0.05)。在细胞外液中加入瞬时感受器电位(transient receptorpotential,TRP)通道阻断剂SKF96365(30μM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神经元膜电位去极化作用减少到2.7 mV±0.6 mV(n=5,P<0.05)。在细胞外液加入NiCl2(3 mM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神经元膜电位去极化作用减少到2.4±0.7 mV(n=5,P<0.05)。在细胞外液加入钠.钙交换泵阻断剂KB-R7943(60μM)后,蛙皮素(250 nM)引起的NPY神经元膜电位去极化作用减少到2.3±0.9mV(n=6,P<0.05)。⑹水迷宫实验中,缺血组大鼠在目标象限停留的时间(ischemia:24.7±3.8％；sham:37.8±6.1％:ischemia+bombesin:35.5±3.6％)显著缩短。而假手术组(P<0.05,ischemiavs sham)和蛙皮素组(P<0.05,ischemia vs ischemia+bombesin)停留时间较长。⑺在体LTP实验中,缺血组大鼠标准化的群峰电位的斜率明显减少(ischemia:114.0±3.1％；sham:129.8±4.5％,P<0.05),而在蛙皮素组,标准化的群峰电位的斜率与假手术组无显著差异(ischemia+bombesin:125.8±4.3％,P>0.05 vs sham；P<0.05 vs ischemia)。⑻电压钳实验中,给予蛙皮素(250HM)后,钠电流幅值变为原来的83.32±5.98％(n=6,P<0.05),而洗脱后电流幅值恢复到原来的97.55±2.19％(n=6,P>0.05)。
结论：①蛙皮素能够可逆的兴奋NPY神经元和POMC神经元,并且具有浓度依赖性。②蛙皮素兴奋NPY神经元的机制可能来自激活非选择性阳离子通道和钠-钙交换泵。③蛙皮素能够改善双侧颈总动脉结扎脑缺血大鼠模型的学习和记忆障碍。④蛙皮素的神经保护作用可能与其抑制电压门控钠离子通道有关。