论文部分内容阅读
一、研究目的1.体内实验采用人肝癌HepG2细胞BALB/C裸鼠移植瘤模型,通过比较给药后肿瘤体积大小及实体瘤重量,观察叶下株复方Ⅱ号的体内药效学作用效果,评价叶下株复方Ⅱ号体内的抑瘤作用。2.体外实验通过观察叶下株复方Ⅱ号对人肝癌细胞HepG2细胞增殖、集落形成和细胞迁移的抑制作用,以及对细胞周期和凋亡的影响,评价叶下株复方Ⅱ号体外抗肝癌的作用效果;研究叶下株复方Ⅱ号作用于HepG2细胞后,对HNF-4α、miR-122表达及Wnt/β-catenin信号通路活化的影响,从分子水平探讨其抗肝癌的作用机制。二、实验内容1.叶下株复方Ⅱ号对BALB/C裸鼠肝癌HepG2细胞移植瘤的抑制作用建立BALB/C裸鼠肝癌HepG2细胞皮下种植瘤模型,随机分为5组:模型组,叶下株复方Ⅱ号高、中、低剂量组和5-Fu阳性药对照组。连续给药6周,每周测量体重变化和实体瘤体积大小,于末次给药后24h后处死,剥离瘤组织称重并拍照。结果显示,叶下株复方Ⅱ高、中、低剂量组的肿瘤重量明显减轻、体积明显减小,与模型组比较,差异均具有显著性差异(P<0.01)。叶下株高、中、低剂量组的肿瘤抑制率分别为65.8%、59.6%和58.4%;与5-Fu对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05),表明叶下株复方Ⅱ号干预,具有明显的抑制肝癌实体瘤生长作用。2.叶下株复方Ⅱ号抗肝癌的药效作用及机理研究2.1叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用体外实验采用人肝癌HepG2细胞,运用MTT法,测定叶下株复方Ⅱ号对HepG2细胞增殖抑制作用效果,结果显示叶下株复方Ⅱ号能明显抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,其作用呈明显的量-效关系,其24h、48h、72h的半数抑制浓度(IC50)分别24.4±1.4mg/ml、21.0±1.3mg/ml、14.2±1.2mg/ml。且随着时间的延长,抑制作用明显增加。2.2叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞集落形成能力的影响叶下株复方Ⅱ号作用HepG2细胞10d后,Giemsa染液染色,显微镜下计数大于50个细胞克隆数,然后按下式计算集落形成率。其结果显示,叶下株复方Ⅱ号不同浓度(5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml)作用于 HepG2 细胞后,集落形成抑制率分别为2.1%、27.9%、38.2%、48.1%、90.2%,即随给药浓度的升高,集落形成抑制率依次升高,且当浓度在2mg/ml以上时,具有显著性抑制集落形成的作用。2.3叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞迁移能力的影响培养至细胞长满培养板后,在24孔板上画“一”字,细胞对照组加入完全培养基,叶下株复方Ⅱ号给药组,分别加入含药浓度为20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml的1640完全培养基,分别在Oh、24h、48h、72h时,拍照。其结果显示,与细胞对照组相比,各浓度的叶下株复方Ⅱ号明显抑具有制细胞的迁移的作用,且随着作用时间的延长,抑制作用明显增强。2.4叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞周期的影响参考48h的IC50浓度,我们设置叶下株复方Ⅱ号剂量组(分别为20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml),空白对照组,5-Fu组。叶下株复方Ⅱ号作用HepG2细胞48h,收集细胞,加入PI染液,使用流式细胞仪检测细胞周期的变化,与对照组相比较,叶下株复方Ⅱ号各浓度剂量组G0/G1期细胞比例明显降低,S期细胞比例显著增加,且随着叶下株复方Ⅱ号浓度的增加,周期阻滞作用明显增强差异具有统计学意义(P<0.01)。2.5叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响叶下株复方Ⅱ号作用HepG2细胞48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,其细胞早期凋亡率和总凋亡率与细胞对照组相比,具有显著性差异(P<0.01)。在10mg/ml以上浓度时,明显具有诱导细胞早期凋亡的作用,且随着叶下株复方Ⅱ号浓度的增加,其诱导细胞凋亡的作用也增强;在浓度为20mg/ml时,其早期凋亡率与5-Fu组无显著性差异。2.6叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞miR-122和Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。叶下株复方Ⅱ号作用人肝癌HepG2细胞48h,采用qRT-PCR检测miR-122、Wnt1mRNA、β-cateninmRNA和HNF-4 α mRNA的表达变化。结果显示与对照组比较,叶下株复方Ⅱ号高、低剂量组miR-122、HNF-4α mRNA的表达量明显升高(P<0.01、0.05);Wnt1mRNA、β-cateninmRNA的表达量明显降低(P<0.01、<0.05)。提示叶下株复方Ⅱ号能够促进HNF-4αmRNA的表达,进而上调miR-122的表达,导致Wnt1mRNA、β-cateninmRNA的表达下降,使得Wnt1/β-catenin信号通路的转导受阻,最终抑制肝癌细胞的生长。三、结论1.叶下株复方Ⅱ号对BALB/C裸鼠肝癌HepG2细胞皮下种植瘤的形成具有明显的抑制作用,显示采用叶下株复方Ⅱ号干预治疗,具有明显的抑制肝癌实体瘤生长作用。2.叶下株复方Ⅱ号对人肝癌HepG2细胞增殖有明显的抑制作用,能显著地阻滞HepG2细胞于S期,使S期DNA合成受阻,细胞不能进入分裂期,从而抑制癌细胞的生长。同时叶下株复方Ⅱ号能显著影响HepG2细胞集落的形成,阻滞该细胞的迁移,并诱导细胞的凋亡。叶下株复方Ⅱ号的抗肝癌的作用机制可能与促进HNF-4 α mRNA的表达、进而上调miR-122的表达有关,使得Wnt1/β-catenin信号通路的转导受阻,导致肝癌细胞周期阻滞,增殖抑制,迁移受阻并诱导凋亡,起到抗肝癌的作用。