论文部分内容阅读
目的:1.阐明GDF11体外调控骨关节炎发生发展的作用及分子机制;2.阐明GDF11体内调控骨关节炎发生发展的作用及分子机制;方法:1.利用免疫组化检测人和大鼠OA及对照组关节软骨中GDF11表达情况。2.通过10ng/ml的IL-1β刺激大鼠软骨细胞24h,诱导体外骨关节炎模型。选用5,10,20ng/ml浓度的GDF11预处理软骨细胞2h,再用10ng/ml的IL-1β刺激24h进行相应的体外实验。通过CCK8检测GDF11对软骨细胞增殖及毒性作用,迁移侵袭（Transwell）试验和划痕（Wound-heal）试验检测GDF11对软骨细胞迁移影响。3.通过Western blot（WB）、细胞免疫荧光检测软骨细胞基质（college2,aggrecan,Timp3,MMPs,ADAMTS）、炎症介质（INOS,COX2,HMGB1,TNF-α）表达,探究GDF11对IL-1β诱导软骨细胞外基质降解及炎症的影响;4.通过WB检测凋亡相关指标（Bax/Bcl2,cleaved-caspase3）的表达,以及通过ROS,JC-1,TUNEL染色,检测GDF11对IL-1β诱导软骨细胞凋亡及氧化应激的影响;5.通过WB检测衰老相关指标（p16,p21）,SA-β-gal染色检测软骨细胞衰老状况,探究GDF11对IL-1β诱导软骨细胞衰老的影响;6.运用WB检测自噬相关指标（Atg5,Atg7,p62,LC3）,GFP-RFP-LC3腺病毒感染试验检测软骨细胞自噬流水平,探究GDF11对IL-1β诱导软骨细胞自噬减弱的影响;7.经不同时间IL-1β处理软骨细胞后,WB检测MAPK和PI3K-AKT/NF-κB相关通路信号分子表达,并选取磷酸化通路激活效果最明显时间点,用于进一步实验。GDF11预处理大鼠软骨细胞2h后,IL-1β刺激0.5h,检测MAPK和PI3K-AKT/NF-κB相关通路信号分子的表达情况,探究GDF11对IL-1β诱导软骨细胞MAPK和PI3K-AKT/NF-κB通路激活的影响。8.体内实验:通过ACLT+DMM构建体内大鼠骨关节炎模型。将30只SD大鼠随机分成三组:（1）sham组;（2）PTOA组;（3）PTOA+AI-GDF11组。术后一周,PTOA+AI-GDF11组大鼠,右膝关节腔内注射重组大鼠GDF11细胞因子（15μg/kg体重,隔天1次）,sham组和PTOA组注射生理盐水。8周后大鼠处死,取造模侧膝关节,脱钙包埋后进行番红-固绿、甲苯胺蓝、免疫组化（COL2、MMP13、Cleaved-caspase3、Beclin1）、TUNEL染色,OARSI评分,探究GDF11对实验性PTOA大鼠作用及机制。结果:1.软骨免疫组化结果表明:GDF11在人和大鼠OA关节软骨中的表达减少;2.CCK8检测、划痕试验和Transwell试验结果证实:GDF11可促进大鼠软骨细胞增殖及迁移;3.WB及细胞免疫荧光等结果表明:GDF11可逆转IL-1β诱导COL2和Timp3的下调及INOS、COX-2、HMGB1、TNF-α、MMP1、MMP13和ADAMTS5的上调,减轻了IL-1β诱导的细胞外基质的降解及炎症因子释放。4.我们还发现GDF11抑制IL-1β诱导cleaved-caspase-3、Bax/bcl-2表达,TUNEL、JC-1染色结果也与上述结果相符,同时ROS检测也证实GDF11抑制IL-1β诱导软骨细胞ROS的产生,阐明GDF11可减弱IL-1β诱导软骨细胞凋亡和ROS的产生;5.我们还发现GDF11抑制IL-1β诱导p16、p21表达及促进Cyclin D表达,阐明GDF11可抑制IL-1β诱导软骨细胞衰老,SA-β-gal染色也与上述结果相符;6.WB结果显示GDF11可显著减弱IL-1β对ATG5、ATG7、LC3的抑制作用及对p62的促进作用,同时,使用GFP-RFP-LC3腺病毒的自噬性检测也证实了GDF11可逆转IL-1β诱导的自噬性缺失。7.GDF11可能通过抑制IL-1β激活的MAPK和PI3K-AKT/NF-κB通路,发挥抗骨关节炎作用。8.在体内,与PTOA组相比,PTOA+AI-GDF11组,番红-固绿及甲苯胺蓝染色结果表明大鼠软骨破坏明显减轻,同时,MMP13、cleaved-caspase3表达明显减少,而COL2、Beclin1表达明显增加;TUNEL试验也证实关节腔注射重组大鼠GDF11细胞因子可抑制关节炎大鼠软骨的凋亡,OARSI评分也证实关节腔外源性给予GDF11,可延缓大鼠软骨退变。总之,上述结果表明,关节腔注射重组大鼠GDF11细胞因子具有抗骨关节炎作用。结论:1.骨关节炎软骨中,GDF11表达减少;2.重组大鼠GDF11细胞因子可抑制IL-1β诱导大鼠软骨细胞细胞外基质降解、炎症、凋亡、衰老及自噬损害,可能通过抑制MAPK和PI3K-AKT/NF-κB通路,发挥上述作用;3.关节腔注射重组大鼠GDF11细胞因子,可延缓大鼠软骨退变,发挥抗骨关节炎作用。