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研究背景和目的:在肾脏疾病进展的过程中,肾间质纤维化程度与肾功能的减退密切相关。缺氧可通过诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞表型转化(EMT)参与肾间质纤维化的发生发展,但是缺氧诱导肾小管上皮细胞-间充质转化的机制仍未明确。研究发现,缺氧诱导的病理损伤与胆绿素还原酶(biliverdin reductase, BVR)密切相关。胆绿素还原酶(BVR)过去被认为是降解胆绿素的关键酶,现有资料表明BVR还具有酪氨酸蛋白激酶的活性,它在结构上与激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的酪氨酸蛋白激酶相似。而PI3K/Akt信号通路激活是各种刺激诱发上皮细胞-间充质转分化的共同通路。因此我们怀疑缺氧通过BVR激活PI3K/Akt信号通路促进了肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(EMT)。为此,本实验构建了慢性缺氧性肾小管上皮细胞-间充质转分化模型,拟通过BVR稳定转染和BVR-siRNA敲除的方法,探究BVR在肾纤维化中的作用,及其与PI3K/Akt信号通路的关系。方法:(1)观察体内体外缺氧与BVR的关系:5/6肾切除法诱导大鼠慢性缺氧性肾间质纤维化,应用免疫组化法检测大鼠肾脏皮质BVR的分布,Westernblot法测定BVR和缺氧诱导因子(HIF-1α)的蛋白水平,体外检测缺氧HK-2细胞BVR水平的变化。(2)观察BVR对肾小管EMT的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系:构建pcDNA3.1/Zeo/BVR重组质粒,稳定转染HK-2细胞。用Western blot法检测BVR转染细胞BVR、E-cadherin和Vimentin的蛋白表达,免疫荧光共聚焦检测E-cadherin和α-SMA的分布,单层细胞划痕愈合实验观察BVR转染细胞的迁移能力。采用PI3K特异抑制剂干预转染细胞,检测正常细胞、BVR转染细胞和PI3K抑制细胞的AKT、p-AKT、E-cadherin、Vimentin、α-SMA改变。(3)观察BVR对缺氧诱导肾小管EMT的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系:Western blot法检测缺氧的HK-2细胞BVR、E-cadherin和Vimentin的蛋白表达,免疫荧光共聚焦检测E-cadherin和α-SMA的分布。采用PI3K特异抑制剂干预缺氧HK-2细胞,检测正常细胞、缺氧细胞和PI3K抑制的缺氧细胞AKT、p-AKT、E-cadherin、Vimentin、α-SMA的改变。通过肾组织连续切片,免疫组化法检测假手术组(Sham组)和肾衰组(Nx组)肾组织BVR和p-AKT的分布,观察体内BVR和p-AKT的关系。将BVR-siRNA片段转染缺氧的HK-2细胞,观察特异性沉默BVR表达对缺氧诱导的HK-2细胞上皮表型转化的影响。利用DCFH-DA探针检测正常细胞、缺氧细胞、缺氧BVR-siRNA细胞和缺氧BVR转染细胞的活性氧(ROS)。结果:(1)假手术组仅部分肾小管有BVR表达,而肾衰组几乎所有小管均有表达。WesternBlot示肾衰组BVR和HIF-1α表达增加,二者呈明显正相关。体外HK-2细胞缺氧也可引起BVR表达上调,并持续到48h。(2)BVR转染肾小管上皮细胞后,细胞形态改变明显,类圆形的小管细胞被长梭形细胞替代,上皮细胞标志E-cadherin减少,并出现肌成纤维细胞标志α-SMA和间充质细胞标志Vimentin的表达。单层细胞划痕愈合实验转染细胞迁移能力增强,示BVR能够促进肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化。对BVR稳定细胞系AKT的磷酸化状态检测证实,转染后AKT磷酸化状态显著增强。PI3K抑制剂抑制转染细胞PI3K 48小时后,磷酸化AKT(p-AKT)相应减少,细胞形态改变出现逆转,细胞逐渐恢复成类圆形正常小管细胞,E-cadherin增加、α-SMA和Vimentin减少。(3)缺氧后HK-2细胞上皮细胞标志E-cadherin减少,并出现肌成纤维细胞标志α-SMA和间充质细胞标志Vimentin的表达,说明缺氧能够促进肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化。对HK-2细胞AKT的磷酸化状态检测证实,缺氧后AKT磷酸化状态显著增强。PI3K抑制剂抑制缺氧HK-2细胞PI3K后,磷酸化AKT(p-AKT)相应减少,E-cadherin表达增加并且逐渐恢复到细胞膜和细胞连接处,α-SMA和Vimentin则相应减少。利用BVR-siRNA抑制缺氧HK-2细胞BVR表达后,上述改变都得到了有效逆转。流式细胞仪测定细胞内活性氧发现,BVR-siRNA抑制缺氧HK-2细胞BVR的表达后,细胞内活性氧反而进一步加剧,而在缺氧处理的BVR稳定转染的HK-2细胞,这种活性氧激活状态却得到有效抑制。结论:(1)缺氧能够增加肾小管上皮细胞BVR的表达(。2)BVR能够激活PI3K/AKT信号通路,促进肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化。(3)活性氧激活-BVR-PI3K/AKT通路是缺氧诱导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化的重要途径。总之,类似一把双刃剑,尽管作为抗氧化家族成员,胆绿素还原酶在慢性肾衰竭时保护性上调,但是由于它同时激活肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化的核心环节PI3K/AKT通路,因此促进了肾纤维化的发生。