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miRNA作为一类可以在转录后调控基因表达水平的非编码RNA大家族的重要小分子,从被发现后,经过数年的探索,逐渐为人们所了解。越来越多的证据表明,miRNA在不同的神经生物学过程,如细胞增殖,生长,分化,凋亡,和神经活动中发挥重要作用。miRNA在神经调节中的功能和作用已经被人们在许多方面所认识,已被发现与大量中枢神经系统疾病有关联。研究表明,哺乳动物等高等动物和人类视神经受到损伤后其再生能力很有限,而且miRNAs的表达在中枢神经损伤再生的不同时期发生着明显的变化。鱼类和两栖类的中枢神经系统具有再生的能力已经被研究证明,而视神经作为中枢神经系统的一部分,具有易于进行试验处理等特点,因此本试验以斑马鱼为模型探寻视神经损伤再生过程中相关miRNAs的表达变化以及调控功能,将会有助于了解中枢神经损伤再生过程中miRNA的分子调控机理。作为神经病学的一个新的研究领域,miRNA和神经系统疾病的关系已经引起人们的重视。根据目前研究现状,为了进一步促进对miRNA与视神经损伤再生功能间的关系的理解,本研究构建了斑马鱼视神经损伤相关的A、B、C、D四个小RNA c DNA文库(A组为对照组,B、C、D为三个实验组,其中B组为视神经损伤1天组、C组为视神经损伤4天组、D组为视神经损伤7天组)。通过对四个小RNA文库的高通量测序和后续生物信息学分析,鉴定了视神经损伤不同时期的miRNAs。并选择其中鉴定到的miRNAs,通过实时定量PCR分析进一步描述了它们在损伤不同阶段的表达谱,从而以丰度表达差异变化阐述了miRNA与神经损伤修复之间的关系。主要研究结果如下:1.在四个sRNA文库A、B、C和D组中分别鉴定得到17,839,945、15,607,126、15398526和16771780条原始序列。除去低质量读数、接头序列、污染等后,四个文库中高质量读数序列分别占原始读数的98.74%、98.94%、98.94%和98.87%。另外,在高质量读数中,A、B、C和D组四个文库中大于等于17nt的纯净序列读数分别占66.51%、75.37%、73.66%、72.72%。2.与斑马鱼miRNA成熟体序列对比,在四个文库中共鉴定到204种保守的miRNAs,在A、B、C和D组库中分别被鉴定到193、199、196、199种保守的斑马鱼miRNA,对其分析,其中189种为四个文库中共有的,分别有3、1、2种仅在A、B和C组中存在,在A和B组、A和C组、A和D组、C和D组之间各有1种共存,2种在A、B和C组中存在,1种在A、B和D组中存在,2种在A、C和D组中存在。3.通过Mireap软件进行预测,在四个sRNA文库中共发现23种新的miRNAs。其中有七种在四个文库中都有表达,四种只在对照组A组中表达,三种只在B组中表达,一种只在C组中表达,一种只在D组中表达。两种在A、C和D组中表达,而其他四种miRNAs分别以不同的组合在不同时期表达。4.在四个文库中鉴定的成熟的miRNAs中,它们各自在文库中的表达量不同,一些miRNAs的表达量在文库中占有明显的优势地位,不同miRNAs的丰度存在较大差异,其变化从稀有miRNAs的几个计数到最丰富miRNAs的几百万读数,例如,mi R-21、mi R-22和mi R-99呈现超过150000的高丰度表达,而mi R-124、mi R-129、mi R-184、mi R-203和mi R-738的Reads仅在10000以上,mi R-132、mi R-15、mi R-206、mi R-7和mi R-92的Reads却只有几千。选择部分miRNAs用实时定量PCR做进一步验证,结果显示,实时定量PCR的结果和高通量测序结果趋势一致。5.对四个文库中表达的已知miRNAs的差异表达进行筛选,A和B组两个文库中有48个miRNAs的表达出现了差异,A和C组中共有47个miRNAs的表达出现了差异,A和D组中共有55个miRNAs的表达出现了差异,B和C组中共有43个表达差异的miRNAs,B和D组中共有37个表达差异的miRNAs,C和D组中共有42个表达差异的miRNAs。6.对照斑马鱼的参考序列,共为24种高度保守miRNAs预测匹配到了8085个靶基因。对这些预测靶基因进行了GO富集分析和KEGG通路分析,验证了这些保守miRNAs的功能和通路与视神经再生的相关性。