论文部分内容阅读
研究背景:TMZ-POH是替莫唑胺(TMZ)和紫苏醇(POH)偶联产生的一种新型替莫唑胺类似物,TMZ-POH在非小细胞肺癌中的抗肿瘤作用主要取决于它可以诱导活性氧(ROS)的大量累积。累积的ROS可以引起线粒体融合与分裂的失衡及线粒体损伤,进而启动线粒体自噬来清除功能失调的线粒体来维持细胞生存。因此我们提出这样一个假说,TMZ-POH在非小细胞肺癌中诱导ROS的大量累积来发挥抗肿瘤作用可能是通过损伤线粒体自噬来实现的。目的:阐明TMZ-POH对非小细胞肺癌细胞系中线粒体自噬的作用及调控机制,观察TMZ-POH对非小细胞肺癌细胞凋亡和辐射敏感性的作用。方法:采用蛋白印迹实验检测自噬,线粒体分裂与融合,溶酶体功能和膜转运相关的蛋白;通过透射电镜和免疫染色观察自噬体,线粒体和溶酶体;运用流式细胞术检测细胞凋亡和免疫荧光探针分析。结果:在A549,SPC-A1,H460以及H520细胞中,TMZ-POH能明显引起LC3B-II蛋白表达的升高,并具有浓度依赖性;使用Baf.A1预处理后,Western Blot实验和免疫荧光检测TMZ-POH处理较对照组LC3B-Ⅱ蛋白的表达无明显变化;TMZ-POH处理较对照组,BECN1和MTOR通路相关蛋白MTOR,pho-MTOR和P70S6K的表达并无明显变化。在A549,SPC-A1中,用内膜蛋白COX-IV和外膜蛋白TOM20标记线粒体,免疫荧光观察线粒体形态,TMZ-POH处理组能够诱导更多损伤的线粒体出现;在线粒体蛋白中,TMZ-POH处理组能够引起LC3B-II明显高表达,但在胞浆蛋白中TMZ-POH仅能诱导LC3B-II轻度高表达;免疫荧光显示TMZ-POH处理组中TOM20和Parkin与LC3B-II有更好的共定位。在A549和H460细胞中,TMZ-POH处理组能够明显上调SQSTM1的表达;流式细胞术检测TMZ-POH的作用效果与Baf.A1类似,能够显著增强MTG的荧光强度;在A549细胞中,免疫荧光观察到TMZ-POH处理组中溶酶体与线粒体的共定位关系较差;免疫荧光观察感染了mRFP-GFP-LC3腺病毒的A549和SPCA1细胞中,TMZ-POH处理组呈现出自噬体的黄色荧光而非自噬溶酶体发出的红色荧光;在A549和SPCA1细胞中,流式细胞术检测TMZ-POH处理组LTR的荧光强度明显降低。Western Blot实验证实TMZ-POH处理组中EEA1,CTSD的成熟体表达明显下调;在A549细胞中,TMZ-POH处理组LC3B与LAMP1共定位关系显著下降。Western Blot实验证实,TMZ-POH处理组中RAB7A的活性下降,LAMP1,LAMP2,RAB7A,RILP等蛋白表达明显下降,而Mevalonate通路激动剂MVL和GGOH能上调TMZ-POH处理组中RAB7A蛋白的表达。在A549和SPCA1细胞中,流式细胞术检测发现3MA可以显著上调TMZ-POH处理组诱导细胞凋亡的能力;相比于0Gy对照组,TMZ-POH处理组联合10Gy照射后的细胞凋亡比例显著增加,并且随TMZ-POH浓度的增加而增加。结论:TMZ-POH能显著诱导自噬体的聚集,且这一过程不受MTOR通路的影响。TMZ-POH可以导致非小细胞肺癌细胞线粒体分裂与融合的动态失衡,损伤线粒体,进而诱发线粒体自噬,同时又通过抑制溶酶体的酸性和成熟,阻断溶酶体与自噬体的融合以及抑制RAB7A的表达来阻断线粒体自噬流的通畅。更为重要的是,TMZ-POH可以增强放疗对非小细胞肺癌细胞的杀伤作用。阐明了TMZ-POH在非小细胞肺癌细胞中通过诱导ROS升高发挥抗肿瘤作用的机制,展现了TMZ-POH作为一种潜在的放疗增敏剂的可能性。