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肿瘤血管形成在肿瘤的生长、侵袭及转移过程中发挥重要作用,为肿瘤持续生长提供营养,并为肿瘤细胞进入循环系统提供通路。肿瘤血管形成是一个复杂的多步骤过程,肿瘤细胞及血管内皮细胞释放血管生成因子,促血管生成因子与内皮细胞上的相应受体结合,进一步激活内皮细胞,使其分泌基质蛋白酶降解血管基膜,被激活的内皮细胞不断增生、移行并装配成新生毛细血管管腔,然后合成新生血管基膜,从而促进新血管生成。大量研究表明,植物中的多种黄酮类化合物(flavonoes compounds)具有清除自由基、抗氧化、抗菌以及雌激素样等多种生物学活性,对肿瘤及心血管等疾病具有良好的预防作用,其在抗肿瘤血管生成方面也引起了广泛关注。甘草素是从甘草中提取的一种二氢黄酮单体化合物,本实验室前期研究表明,甘草素能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞和宫颈癌HeLa细胞的增殖,并经线粒体氧化应激通路诱导细胞凋亡。经体内实验发现,甘草素能延长H22荷瘤小鼠的生存时间,并能抑制瘤体增生及诱导肿瘤组织细胞凋亡。然而,有关甘草素是否具有抑制肿瘤血管生成的作用尚不清楚。本课题拟通过人宫颈癌HeLa细胞及人脐静脉内皮HUVEC细胞模型,应用Western blot、RT-PCR和管腔形成实验等多种分子生物学技术,研究甘草素对肿瘤血管生成的作用,探讨甘草素对血管生成相关靶向因子VEGF和HIF-1α的调控作用,以及PI3K/AKT和ERK1/2信号转导通路在阻断肿瘤细胞血管生成过程中的介导作用。通过本课题的研究,进一步阐明甘草素抑制肿瘤血管生成的作用及其相关分子机制,为研究天然植物黄酮单体化合物甘草素潜在的肿瘤化学预防作用提供科学依据。目的:探讨甘草素对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移及管腔形成的影响,并研究PI3K/AKT/p70S6K和ERK1/2信号转导通路在调控血管生成相关靶向因子VEGF和HIF-1α蛋白表达中的作用。方法:本研究经体外培养HUVEC细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察甘草素对HUVEC细胞增殖的影响;划痕试验观察甘草素对HUVEC细胞迁移能力的影响;Matrigel胶体外小管形成试验检测甘草素对HUVEC细胞管腔形成的影响;通过Western blot方法检测甘草素对HUVEC细胞中VEGF和HIF-1α蛋白表达的剂量依赖性效应,并研究其对相关通路PI3K/AKT/p70S6K及ERK1/2通路的介导作用。结果:(1)不同剂量甘草素(25、50、75、100、200和300μM)分别处理HUVEC细胞12、24、48h后,均能有效降低细胞存活率,并呈剂量-时间依赖效应。当25μM甘草素作用HUVEC细胞12、24、48h后,细胞存活率分别为90.76%、88.54%和86.3%;300μM甘草素处理HUVEC细胞相同时间后细胞存活率分别下降至68.16%、63.68%和57.19%。(2)当甘草素25~100μM处理HUVEC细胞12h后,可明显抑制HUVEC细胞的迁移及管腔形成,并随着剂量增加,细胞迁移和管腔形成能力均下降。(3)Western blot实验结果显示,甘草素可阻断PI3K/AKT/p70S6K和ERK1/2信号转导通路从而抑制胞内VEGF和HIF-1α的蛋白表达,并呈一定剂量依赖效应,分别采用PI3K抑制剂LY294002、p70S6K抑制剂Rapamycin和ERK1/2抑制剂U0126处理细胞,可见PI3K/AKT/p70S6K和ERK1/2信号转导通路介导的VEGF和HIF-1α表达也下调,所得结果与上述一致。结论:甘草素抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖、迁移及管腔形成,阻断PI3K/AKT/p70S6K和ERK1/2信号转导通路,并下调其介导的VEGF和HIF-1α表达。目的:探讨甘草素对人宫颈癌HeLa细胞血管生成相关因子VEGF和HIF-1α的影响,及其与PI3K/AKT/mTOR-p70S6K和ERK1/2信号转导通路的关系。方法:应用RT-PCR法检测HeLa细胞中VEGF、HIF-1αmRNA的表达水平;应用Western blot方法检测甘草素对HeLa细胞中VEGF、HIF-1α蛋白及PI3K/AKT/mTOR-p70S6K和ERK1/2信号通路相关蛋白表达的作用,并观察甘草素对细胞内HIF-1α蛋白降解及合成的影响。结果:(1)不同剂量甘草素(0、25、50、75和100μM)分别处理HeLa细胞12h后,随着剂量的增加,VEGF蛋白表达和mRNA水平均显著降低,而HIF-1α仅在蛋白表达上有变化,mRNA水平无明显变化。(2)采用放线菌酮(CHX)和蛋白酶体抑制剂(MG132)进一步处理细胞,观察HIF-1α蛋白的降解与合成情况,结果表明甘草素通过促进蛋白降解与抑制蛋白合成途径下调HIF-1α的蛋白表达。(3)甘草素可抑制PI3K/AKT/mTOR-p70S6K信号通路中相关蛋白,并呈一定剂量依赖效应,分别采用PI3K抑制剂LY294002和p70S6K抑制剂Rapamycin处理细胞,可见PI3K/AKT/mTOR-p70S6K信号转导通路介导的VEGF和HIF-1α的表达也下调,所得结果与上述一致,而甘草素对ERK1/2通路并没有影响。结论:甘草素可抑制人宫颈癌HeLa细胞中血管生成相关因子VEGF和HIF-1α的表达,其作用机制可能与PI3K/AKT/mTOR-p70S6K信号通路有关。