研究背景卵巢癌高居妇科恶性肿瘤死亡率之首。早期诊断困难，2／3以上的患者就诊时已属晚期。化疗仍是最重要的治疗手段之一。化疗药物杀伤恶性肿瘤细胞的效力在一定范围内与其剂量强度（dose intensity，ODI）成正比，呈剂量相关性（dose-dependent），但其引起的骨髓抑制作用限制了大剂量化疗药物的应用。研究表明，多药耐药基因（multidrug resistance 1，MDR1）编码表达的P—糖蛋白（P-gp）可以将多种化疗药物泵出细胞外，这是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性的重要机制之一。但是，如果将MDR1基因转入造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC），使之获得耐药表型，就可以在化疗过程中起到保护骨髓的作用，进而使大剂量化疗得以顺利进行，提高化疗的疗效。但是，目前MDR1基因的转染效率很低，在体内不能得到长期有效的表达，限制了其在临床上的应用。逆转录病毒载体是目前应用最多且最安全的基因转染系统，其基因转染效率必须在靶细胞进入分裂周期时才能达到最高。但是，在正常情况下，绝大多数造血干细胞处于静止期，因而基因转染效率极低。众多研究者在深入研究造血干细胞的生物学特性的基础上，开发更为理想的基因载体系统，探索最佳的造血干细胞体外扩增和转染条件，以便找到一整套临床可行的高效的造血干细胞基因转染方案。在目前的研究中，主要采取以下策略：构建新的病毒载体系统（如：采用GALV、VSV-G、RD114等包膜蛋白构建的假性病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体，泡沫病毒载体）；应用细胞因子和／或其组合促进造血干细胞进入分裂周期；采用基质细胞支持培养的体系模拟骨髓造血微环境，促进造血干细胞在体外自我更新；采用纤维连接蛋白（fibronectin，FN）定位病毒与造血干细胞等。用细胞因子进行预刺激成为造血干细胞基因转染的常规方案。然而，细胞因子在促进造血干细胞进入分裂周期的同时，也易使造血干细胞发生分化，损害造血干细胞长期移植的特性。因此如何在诱导造血干细胞进入分裂周期的同时，又保持其自我更新和多系分化的潜能至关重要。基质细胞支持培养的体系模拟体内的造血微环境，可以部分性地对抗细胞因子刺激所诱导的干细胞分化，使造血干细胞在体外能够进行自我更新。基质细胞的来源较多，研究者们从脐带、骨髓和胎肝中分离出多种基质细胞，并将这些基质细胞用SV40转染形成转化细胞系，如卵黄囊CD34⁺内皮细胞、脐静脉内皮细胞系（HUVEC）、MS-5、M2-10B4、HESS-5、HES-1、AFT024、2018和2012细胞系等。这些细胞系可以单独在体外支持造血，但每种细胞系的支持作用的机制和效果又不尽相同。其中，胎肝AFT024细胞系在体外保持造血干细胞长期移植和多系造血潜能方面，比其它的基质细胞系更具优势。研究发现AFT024细胞与造血干细胞共培养时，可以使脐带血CD34⁺CD38^-细胞广泛进入细胞周期，而且更多地进行不对称分裂，这是造血干细胞在产生子代细胞的同时保持其自身特性和数量的特殊分裂方式。因此，我们设想在造血干细胞与AFT024细胞共培养过程中，加入携带MDR1基因的病毒上清，可能增加病毒进入细胞核中的概率，从而提高基因转染效率；而且在扩增造血干细胞的同时，还能够保持其干细胞的特性，使之能够成功植入到受体内，并长期表达MDR1基因。本研究首先在AFT024细胞支持下培养脐带血CD34⁺细胞，并加入病毒上清进行MDR1基因转染，在体外检测基因转染效率及造血干细胞扩增情况；然后将基因转染的细胞移植到亚致死剂量照射的NOD／SCID小鼠体内，研究其是否能够重建造血，及其能否在紫杉醇化疗中起到保护小鼠骨髓的作用。第一部分AFT024细胞对脐带血CD34⁺细胞多药耐药基因转染效率及体外扩增的影响目的：采用AFT024细胞支持的脐带血CD34⁺细胞体外扩增培养，并进行MDR1基因转染的体系，探讨AFT024细胞对造血干细胞的体外扩增及MDR1基因转染效率的作用。方法：将含有人类MDR1基因的逆转录病毒载体pHaMDR1转入包装细胞PA317中，秋水仙碱筛选出耐药克隆后，制备病毒上清。采用免疫磁珠法从脐带血中分离出CD34⁺细胞，在AFT024细胞滋养层的支持下培养7天后，传代并继续在AFT024细胞支持下，加入病毒上清进行MDR1基因转染培养至21天。以无AFT024细胞支持的培养体系为对照组。采用RT-PCR法检测转染细胞内MDR1mRNA的表达；流式细胞术检测P-gp的表达率：罗丹明—123（rhodamine-123，Rh-123）排出试验检测P-gp的功能活性；耐药集落形成试验检测基因转染效率；分别计数有核细胞总数（total nucleated cell，TNC）、CD34⁺细胞和集落形成细胞（colony-forming cell，CFC）的扩增倍数来检测AFT024细胞对造血干／祖细胞扩增的作用。结果：（1）AFT024组的转染细胞中通过RT-PCR法检测到较高的MDR1mRNA水平，其基因转染效率（46.0％）明显高于对照组（15.2％）（P＜0.01）；AFT024组P-gp的表达率为（31.7％±10.2％），明显高于对照组（12.6％±3.9％）（P＜0.01）；Rh-123排出试验显示，AFT024组具有P-gp功能活性的细胞占（35.5％±11.4％），明显高于对照组（16.6％±3.2％）（P＜0.01）。（2）培养至第7天，对照组TNC、CD34⁺细胞和CFC的扩增倍数分别是（12.1±2.6）倍、（2.5±1.0）倍和（4.5±1.4）倍，稍高于AFT024组[分别是（8.2±2.4）倍、（2.3±1.1）倍和（3.5±1.0）倍]。但是，两组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。培养至第14天，对照组TNC的扩增倍数为（102.9±26.6）倍，明显高于AFT024组[（78.9±16.6）倍]（P＜0.05），但是，对照组CD34⁺胞和CFC的扩增倍数分别是（6.6±2.8）倍和（6.7±2.1）倍，低于AFT024组[分别是（16.2±7.6）倍和（9.4±4.0）倍]，其中两组CD34⁺细胞的扩增倍数有统计学差异（P＜0.05）。培养至第21天，AFT024组TNC、CD34⁺细胞和CFC扩增倍数分别是（145.0±26.8）倍、（37.9±13.9）倍和（27.1±13.3）倍，均高于对照组[分别是（132.0±26.7）倍、（9.1±2.3）倍和（7.7±3.6）倍]，其中，两组的CD34⁺细胞和CFC的扩增倍数的差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：AFT024细胞能够明显提高MDR1基因在脐带血CD34⁺细胞中的转染效率，而且具有较强的扩增造血干／祖细胞的能力，CD34⁺细胞和CFC得到明显扩增。第二部分转染多药耐药基因的造血干细胞在NOD／SCID小鼠体内重建造血及化疗后骨髓保护能力的评价目的：探讨体外AFT024细胞支持培养的并转染了MDR1基因的脐带血CD34⁺细胞能否在经亚致死量射线照射的NOD／SCID小鼠体内重建造血，及其在紫杉醇化疗中能否起到保护骨髓的作用。方法：将体外AFT024细胞支持培养并转染了MDR1基因的脐带血CD34⁺细胞（MDR1组）或新鲜分离的脐带血CD34⁺细胞（对照组）移植到经亚致死量射线照射的NOD／SCID小鼠体内，每周采集外周血检测血细胞计数。移植28天后，存活小鼠接受紫杉醇（paclitaxel，PAC，12mg／kg／d×5d）或生理盐水（normalsaline，NS）腹腔注射，其后每周检测外周血血细胞计数。在化疗结束后21天，处死小鼠，流式细胞术检测骨髓中人源CD45⁺细胞即NOD／SCID—再植细胞（NOD／SCID-repopulating cells，SRC）的比例和Rh-123^dull表型的CD45⁺细胞即表达MDR1基因的SRC的比例。结果：（1）造血干细胞移植后，MDR1组小鼠的WBC恢复速度明显快于对照组小鼠，至移植第21天，MDR1组小鼠的WBC数上升至（4.5±0.6）×10⁹／L，而对照组小鼠的WBC数仅升至（2.8±0.8）×10⁹／L，两组相比，差异具有极显著性（P＜0.01）。但至移植后第28天，MDR1组和对照组小鼠的WBC数分别上升至（4.4±0.9）×10⁹／L和（4.7±0.9）×10⁹／L，差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）接受紫杉醇腹腔化疗后，MDR1-PAC组小鼠的死亡率是10％（1／10），而对照-PAC组小鼠的死亡率是50％（5／10）。MDR1-PAC组小鼠WBC降至最低值的时间比对照-PAC组早，MDR1-PAC组小鼠的WBC于化疗第7天降至最低值（2.3±1.4）×10⁹／L，之后WBC开始回升，至第14天，WBC升至（3.14±1.4）×10⁹／L，而对照-PAC组小鼠的WBC于第14天降至最低值（1.2±0.7）×10⁹／L。MDR1-PAC组小鼠WBC的最低值明显高于对照-PAC组（P＜0.05），而且由于前者造血恢复开始也较早，至第21天MDR1-PAC组小鼠的WBC升至（5.4±1.2）×10⁹／L，明显高于对照-PAC组小鼠（3.8±1.0）×10⁹/L]（P＜0.05）。（3）化疗期间仅接受生理盐水注射的MDR1-NS组和对照-NS组小鼠骨髓中CD45⁺细胞的比例分别为（48.8％±17.0％）和（50.2％±12.7％）。接受紫杉醇注射的两组小鼠的CD45⁺细胞的比例明显低于接受生理盐水注射的两组小鼠（P＜0.01），其中MDR1-PAC组小鼠的CD45⁺细胞比例（31.0％±12.5％）稍高于对照-PAC组小鼠（21.8％±8.5％），但差异无统计学意义（P＞0.05）。（4）MDR1组小鼠紫杉醇化疗后Rh-123^dullCD45⁺细胞的比例是（38.8％±12.9％），明显高于仅接受生理盐水注射组（18.7％±7.5％） （P＜0.01）。对照组小鼠接受紫杉醇化疗后Rh-123^dull CD45⁺细胞的比例是（4.1％±1.8％），而仅接受生理盐水注射组是（3.8％±1.1％），两组相比，无统计学差异（P＞0.05）。结论：体外AFT024细胞支持培养的并转染了MDR1基因的脐带血CD34⁺细胞，能够在亚致死剂量照射的NOD／SCID小鼠体内重建造血，而且造血恢复的速度快于新鲜分离的脐带血CD34⁺细胞；在紫杉醇化疗后，移植的转染MDR1基因的造血干细胞能够保护小鼠骨髓，减轻紫杉醇对骨髓的毒性作用，降低死亡率。