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脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)是引起仔猪发病的一种较重要的病原,可以引起仔猪脑炎、心肌炎和心肌周围炎,以及母猪繁殖障碍,并使其他成年猪呈隐性感染状态,表现出亚临床症状,给养猪业带来较大经济损失。本病毒还能感染人类和其他动物,可能诱发自然疫源性人兽共患病,但致病机制尚不十分清楚。EMCV 3C蛋白是病毒的非结构蛋白之一,具有蛋白酶作用,同时能裂解宿主蛋白,对该病毒的致病力有较大影响。本研究构建了表达EMCV 3C蛋白的真核表达载体,通过体外细胞转染,观察了天然免疫IFN-β信号通路相关分子的变化,为阐明EMCV致病机理奠定了基础。具体研究内容如下：1. EMCV3C蛋白的真核表达载体的构建与鉴定本研究以EMCV NJ08株基因为基础,设计引物,通过RT-PCR扩增了EMCV的3C基因片段,克隆到真核表达载体pVAX1上,经双酶切和测序鉴定得到了正确的重组真核表达质粒pVAX1-3C。然后在脂质体2000的介导下,将该重组真核表达质粒转化到HeLa细胞,间接免疫荧光和western blot实验的结果表明,重组的3C蛋白得到了正确的表达,表达产物的分子量与预期相符,为进行3C蛋白的功能研究打下良好基础。2. EMCV3C蛋白对IFN-β信号通路分子的影响本研究将pVAXl-3C质粒转染人的HeLa细胞,双荧光素酶报告基因实验结果显示,pVAXl-3C转染组中FN-β、IRF3及PRDII启动子驱动的荧光素酶的表达量明显低于阴性对照组,表明3C蛋白能抑制IFN-β的产生。Realtime-PCR结果显示,与转染了pVAX1或GST真核表达质粒的HeLa细胞相比,转染了pVAXl-3C的HeLa细胞在受到IFN-β刺激后,ISG15、ISG56、Mx1、OAS、PKR的相对表达量降低。ISRE启动子驱动的荧光素酶活性检测结果为,pVAXl-3C抑制了ISRE启动子的活性,表明3C蛋白能抑制IFN发挥作用的下游信号通路。Western blot结果显示,转染了pVAXl-3C的细胞中STAT1和STAT2蛋白总量不变,磷酸化的STATs(pSTAT1和pSTAT2)总量也保持不变,表明3C蛋白既不引起STAT1和STAT2降解,也不影响STAT1和STAT2的磷酸化水平。免疫沉淀实验的结果显示3C蛋白对STAT1/STAT2/IRF9三聚体形成无影响。本研究结果表明,EMCV3C蛋白能显著抑制干扰素产生的信号通路和干扰素发挥作用的信号通路,抑制宿主细胞天然免疫。